大柴胡汤对重症中暑大鼠肠道黏膜屏障的保护机制研究*

陈冬杰 黄永莲 彭晓洪 黄亚秀 王 评

[北京中医药大学深圳医院（龙岗），广东 深圳 518000]

中暑是夏季高发的危重症之一，其中重症中暑的死亡率仍较高，达10%～50%[1]。现阶段研究认为血管内皮细胞损伤、全身炎症反应和凝血功能紊乱是导致重症中暑发生的主要病理生理机制[2]，而热打击后肠道黏膜损伤所致的肠源性毒素血症则是以上过程的始动因素之一[3]。新近研究发现重症中暑早期，热打击致肠道黏膜屏障损伤，通透性改变，肠道菌群失调，内毒素入血，诱导全身炎症反应进而引起脏器功能损伤[4]。而肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）、D-乳酸水平在肠黏膜受损时会明显升高，因此被认为是肠道黏膜受损的标志物，并且可通过其水平反映肠道的受损伤程度。本课题前期组研究发现大柴胡汤对重症中暑患者有较好疗效，能减轻患者的全身炎症反应程度，改善预后[5]。因此，本研究观察大柴胡汤对重症中暑大鼠血清白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）及D-乳酸（D-LA）水平的影响，探讨大柴胡汤对重症中暑大鼠肠道黏膜屏障的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠60只，质量（200g±30）g，由广东省动物实验中心提供。本实验通过医院伦理审查，大鼠实验前适应性喂养1周。

1.2 试药与仪器 大柴胡汤，组方：柴胡15 g，黄芩9 g，芍药9 g，半夏9 g，生姜15 g，枳实9 g，大枣10 g，大黄6 g。药材由北京中医药大学深圳医院中药房提供，浓煎成含原生药1 g/mL，过滤除菌分装4℃保存备用。BCA蛋白浓度检测试剂盒（碧云天生物技术公司），大鼠IL-1酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、大鼠DLA ELISA试剂盒、大鼠I-FABP ELISA试剂盒、大鼠TNF-α ELISA试剂盒均购自上海美轩生物科技有限公司。高温气候动物培养箱（宁波戴维医疗器械有限公司）、低温冷冻离心机（Thermo公司）、MultiSkan3酶标仪（Thermo公司）、超声波破碎仪（无锡沃信仪器制造有限公司）

1.3 分组与造模 采用随机数字表法将大鼠分为4组：空白对照组、模型组、大柴胡汤标准剂量组、大柴胡汤高剂量组，各15只。将大鼠置于高温气候动物培养箱内，温度（40.5±0.5）℃，湿度（65.0±2.0）%，经直肠测中心体温（Tc），造模期间每隔1 h测1次中心体温，Tc达41℃后每隔15 min测1次体温。以动物直肠温度达42℃作为重症中暑标准。记录动物达到重症中暑标准时间，造模成功后，置于常温环境（23.0±0.5）℃进行自然降温。

1.4 给药方法 造模后6 h开始给药。大鼠灌胃剂量参照血清药理学等效剂量换算公式进行换算：Db=Da×Dab，正常大柴胡汤用药量为1.37 g/（kg·d），成人-大鼠的换算系数Rab=6.17，则200 g大鼠的等效剂量折算为1.69 g/（kg·d），高剂量组为标准剂量组2倍，即3.38 g/（kg·d），中药汤剂用生理盐水稀释至5 mL，每8小时灌胃1次，连续2 d。空白对照组、模型组同时间以等量生理盐水灌胃。

1.5 标本采集与检测 在造模成功后6、24、48 h分别随机取5只大鼠处死，收集腹主动脉血，离心分离血清后采用ELISA检测IL-1、TNF-α、IFABP、D-LA水平含量，操作步骤严格按照说明书进行

1.6 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（）表示，进行χ2检验、单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清TNF-α、IL-1水平比较 见表1。模型组血清TNF-α、IL-1水平持续升高，较空白对照组同时间点均明显升高（P＜0.01）；中药各组血清TNF-α、IL-1水平48 h后逐渐下降，较空白对照组同时间点均明显升高（P＜0.01）；大柴胡汤两组血清TNF-α、IL-1水平在给药后同时间点均显著低于模型组（P＜0.05），且高剂量组降低更明显（P＜0.01）；两组血清TNF-α、IL-1水平比较，高剂量组上述指标同时间点均较标准剂量组显著下降（P＜0.05）。

表1 各组大鼠不同时间点血清TNF-α、IL-1水平比较（pg/mL，±s）

表1 各组大鼠不同时间点血清TNF-α、IL-1水平比较（pg/mL，±s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与大柴胡汤标准剂量组比较，△P＜0.05。下同。

TNF-αIL-1组别48h 20.65±7.19 170.20±6.21#119.12±4.57#**84.12±5.08#**△空白对照组模型组大柴胡汤标准剂量组大柴胡汤高剂量组n 5 5 5 5 6h 13.28±2.91 23.39±3.90#22.73±5.07#25.76±3.63#24h 12.54±4.44 76.99±5.02#69.20±4.32#*59.37±4.30#**△48h 15.94±4.75 90.21±3.02#58.46±5.13#**38.98±5.53#**△6h 24.50±10.52 48.12±3.10#54.23±9.70#53.89±5.13#24h 27.43±6.06 146.75±10.12#132.68±4.93#*112.59±9.64#**

2.2 各组大鼠血清I-FABP、D-LA水平比较 见表2。模型组血清IFABP、D-LA水平持续升高，较空白对照组同时间点均明显升高（P＜0.01）；大柴胡汤两组血清I-FABP、D-LA水平48 h后逐渐下降，较空白对照组同时间点均明显升高（P＜0.01）；大柴胡汤两组血清IFABP、D-LA水平在给药后同时间点均显著低于模型组（P＜0.05），且高剂量组降低更明显（P＜0.01）；两组血清I-FABP、D-LA水平比较，高剂量组上述指标同时间点均较标准剂量组显著下降（PP＜0.05）。

表2 各组大鼠不同时间点血清I-FABP、D-LA比较（μmol/mL，±s）

表2 各组大鼠不同时间点血清I-FABP、D-LA比较（μmol/mL，±s）

I-FABP D-LA组别空白对照组模型组大柴胡汤标准剂量组大柴胡汤高剂量组n 5 5 5 5 6h 140.12±34.75 254.82±38.20#256.60±25.78#264.76±23.81#24h 146.24±27.35 542.58±13.82#504.34±22.23#*453.37±32.38#**△48h 150.57±23.02 618.79±12.31#436.04±27.63#**321.85±22.03#**△6h 41.74±4.50 56.06±4.94#58.14±6.11#57.38±9.12#24h 42.74±4.58 127.87±8.37#114.55±8.51#*90.57±3.09#**48h 20.65±7.19 154.14±10.83#87.35±6.84#**70.38±4.33#**△

3 讨论

重症中暑大鼠在发病过程中，高热的环境直接导致大鼠肠道黏膜受损，通透性增加，导致细菌/毒素更容易经过肠道黏膜进入血液，导致肠源性脓毒症的发生，进而启动炎症风暴，最终造成多器官功能障碍[6-7]。同时，热打击下的大鼠肠道也同时出现了缺血、缺血再灌注的损伤过程[8-9]，进一步加重了肠道黏膜屏障的损伤。而当肠道的机械屏障、生物/化学等屏障被破坏后，各种生物标志物会大量释放入血。肠道黏膜完好的大鼠肠型脂肪酸结合蛋白在外周血液中近微量存在[10]。但一旦肠道缺血，可在15 min内血清中浓度急剧上升，基于此，I-FABP被认为可以反映肠道机械屏障的完整性和受损伤的程度[11]。血清D-LA是肠道内多种细菌在肠道组织缺血、缺氧条件下葡萄糖无氧代谢的产物，产生的D-LA可在肠道黏膜通透性增加时进入血液，并且由于哺乳动物不产生分解代谢D-LA的酶系统，故临床上常通过对其水平的检测来反应机体的缺氧情况以及肠黏膜受损程度和通透性变化[12]。

通过本实验可以发现，在造模成功后重症中暑大鼠的TNF-α、IL-1水平达持续升高，在观察期间仍未达到最高水平，且同期I-FABP、D-LA均升高，而空白对照组中，大鼠的TNF-α、IL-1水平并没有升高，而且同时期I-FABP、D-LA水平也未出现明显变化，证明了重症中暑大鼠在热打击后出现全身炎症反应时，大鼠的肠道黏膜会受到抑制并出现损伤，该结果与国内相关研究结果相一致。并且通过对比模型组和各剂量中药组可以发现，大柴胡汤能够有效降低TNF-α、IL-1及I-FABP、D-LA水平。

重症中暑属于中医学“暑厥”“暑风”范畴。传统认为暑热伤阴耗气，气机逆乱，神明失养为本病主要病机，治以清暑益气，养阴生津为法。近来有学者认为热毒、血瘀与中暑的发生发展密切相关，并运用清热解毒，凉血活血及益气养阴，醒脑开窍的中药治疗中暑患者取得较好疗效[13-14]。本课题组长期临床观察发现，中暑的患者多出现胃肠功能障碍，以腹胀，大便难解为主要症状。基于此，我们认为阳明经腑邪热炽盛，少阳枢机不利是本病的主要病机特点之一，理当和解少阳、通腑泻热。大柴胡汤出自《金匮要略》，为和解少阳、内泻热结的代表方，对多种伴随肠道功能障碍的危重症具有确切疗效。而本研究也确实证明了大柴胡汤对重症中暑大鼠的胃肠黏膜屏障有极好的保护作用。重症中暑的启动器官是肠道，保护肠道功能，西医强调积极降温，早期肠内营养，保持大便通畅，这与中医学“保胃气”“六腑以通为用”的观点不谋而合。

对于大柴胡汤降低I-FABP、D-LA水平的机制，结合本实验结果，可以推测是由于大柴胡汤能够通过抑制炎症反应，减少炎症因子的生成，从而直接减少肠道黏膜的损伤。但是具体通过何种内在途径尚未清楚，因此本实验仍需进一步研究其内在机制，为明确大柴胡汤保护肠道黏膜的分子途径提供证据。且本研究在观察期间，模型组的炎症反应及肠道黏膜屏障受损仍在持续，中药治疗组已呈现下降趋势，证明了大柴胡汤不仅仅能有效治疗重症中暑，且能提早干预并减轻炎症反应，从而起到保护肠道黏膜的作用。

综上，大柴胡汤能够有效抑制重症中暑大鼠的炎症反应，并且对肠道黏膜保护起到作用，其机制可能与通过抑制炎症反应，减少炎症因子生成相关。