疏肝温胆汤对动脉粥样硬化大鼠血脂和miR-613、LXRα mRNA表达的影响*

伍啟华 蔡海荣 张浩波 陈伯钧 刘淑玲△

（1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510006；2.广州中医药大学，广东 广州 510405）

动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的重要病理基础，与缺血性心脑血管疾病的发生发展密不可分[1-2]。研究发现，2020年度我国近期发生脑血管事件患者中，高危颈动脉粥样硬化斑块的检出率为28%[3]，可见AS防治在心脑血管疾病的防治中是必要的。临床实践中，规范的血脂管理、调脂稳斑、抗血小板聚集配合血压、血糖控制等已成为AS基础治疗方案，但服药品类繁多的现状，加重患者心理负担，降低患者治疗依从性，且不良反应也值得关注。

疏肝温胆汤是本文通信作者、广东省名中医陈伯钧教授的经验方，为经典名方柴胡疏肝散和温胆汤的合方。陈伯钧教授认为“气滞血瘀痰湿”是AS的核心病机，且团队在临床实践及动物实验中发现，疏肝温胆汤能够保护内皮功能、改善糖脂代谢、抗炎[4-6]，故拟疏肝温胆汤为防治AS的基础方。有文献指出，MicroRNAs（miRNAs）参与调控与炎症反应及脂类代谢，其中有细胞实验证明miR-613能够靶向针对肝脏LXRα基因，从而参与脂肪酸的合成，进而影响脂类代谢[7]。因此，本研究以miR-613、LXRα为切入点，观察疏肝温胆汤对miR-613、LXRα、血脂相关指标及动脉内皮损伤病理表现的影响，进一步探讨疏肝温胆汤保护动脉内皮的可能机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级4月龄健康SD大鼠60只，体质量160～180 g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2018-0002。分笼饲养于广东省中医药科学院实验动物中心，饲养环境：温度（23±2）℃，湿度（50±5）%。本研究通过广东省中医院动物伦理委员会的批准。

1.2 试药与仪器 疏肝温胆汤，组方：柴胡12 g，枳实15 g，半夏10 g，陈皮15 g，竹茹12 g，甘草6 g，茯苓20 g，白芍15 g，丹参15 g。中药饮片均购自康美药业股份有限公司。按照《药理实验方法学》[8]中人-鼠药物剂量换算，高、中、小剂量分别按照生药含量8.52、4.26、2.13 g/kg灌胃。阿托伐他汀钙片，辉瑞制药有限公司，国药准字号J20171062，批号为20180543，加生理盐水配制成质量浓度0.10 mg/mL的混悬液。高脂饲料按质量分数配方：2%胆固醇、4%猪油、10%蛋黄粉及84%基础饲料。普通基础饲料和高脂饲料购自广东省医学实验动物中心。总胆固醇（TC）、甘油三酯（TAG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒（南京卡米洛生物工程有限公司）；日立7180型自动生化分析仪（日本Hitachi公司）；低温冷冻离心机TGL-16R（Hema公司）；基因扩增仪 Hema9600（Hema厂家）；Real-time Quantitative PCR机器 Bio-Rad CFX-96（Bio-Rad公司）；Trizol（TR118-500，MRC公司）。

1.3 分组与造模 60只大鼠平均分为正常组、模型组、阿托伐他汀组和中药高、中、低剂量组，每组各10只。采用免疫损伤合并高脂饲料诱导合并束缚情志应激法诱导大鼠AS模型。造模第1天正常组一次性尾静脉静脉注射40 mg/kg的生理盐水，喂饲普通饲料，其余各组尾静脉注射40 mg/kg牛血清白蛋白进行免疫刺激，喂饲高脂饲料并配合束缚情志法干预：让大鼠钻进束缚筒并调整好适当的活动空间，水平地板上进行建模，每次束缚30 min，每隔1 h束缚1次，每天束缚4次。束缚间期，实验动物自由摄食。各组动物每日进食总量相等，限制为100 g，分2次，每12小时1次。各组大鼠于8周末行血管超声检查，动脉内膜有粥样斑块形成为造模成功标准。

1.4 给药方法 于造模同时开始给药。按照上述换算标准，中药高、中、小剂量组分别按照8.52、4.26、2.13 g/kg予疏肝温胆汤灌胃；阿托伐他汀组按照15 mg/kg予阿托伐他汀混悬液灌胃；正常组和模型组灌胃等量蒸馏水。各组每日给药1次，共8周。

1.5 标本采集与检测 实验过程中记录大鼠死亡情况，8周末测量体质量、血压（收缩压、舒张压）。1）脂类代谢指标测定。末次给药后禁食不禁饮12 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，逐层打开腹腔，腹主动脉取血10 mL，以3 000 r/min离心15 min，取上清液，-80℃保存，应用全自动生化分析仪检测血清TC、TAG、HDLC、LDL-C水平，计算血浆致动脉粥样硬化指数（AIP），AIP=ln（TG/HDL-C）。2）血管病理变化。处死大鼠，取腹主动脉约2 cm，将新鲜组织标本固定于4%甲醛中24 h以上，选择组织标本的最大切面进行修整后放置于脱水仪依次梯度酒精脱水及浸蜡3 h，包埋、切片，38℃的温箱内过夜，取出室温保存，进行脱蜡水化，苏木素-伊红染液染色，染色后脱水中性树胶封片，显微镜下镜检并拍照。3）miR-613、LXRα测定。取一定量的肝组织，采用RT-qPCR检测miR-613、LXRα的mRNA表达水平。在NCBI上搜索到目的基因，再用primer5.设计引物，引物为miR-613-QPCR-Rat-RT、LXRa-QPCR-Rat-F、LXRa-QPCR-Rat-R，提取组织样品中的总RNA，检测总RNA的纯度、浓度及完整性。cDNA 逆转录；95℃ 120 s（热变性），95℃ 15 s（变性），60℃ 30 s（退火延伸），60～95℃（溶解曲线），总45个循环；再进行目的基因的扩增。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算靶基因的mRNA相对表达水平，所有靶基因的表达在正常组都设为1。每个样品均重复3次。GraphPad Prism软件计算定量结果和数据。

1.6 统计学处理 应用SPSS25.0统计软件进行数据分析，所有计量数据以夏皮洛-威尔克方法（S-W法）结合图示法（直方图、P-P图、Q-Q图）检验正态性，正态数据以（）表示，偏态数据以中位数（P25，P75）[M（P25，P75）]表示。多组比较，正态数据采用单因素方差分析，偏态数据采用秩和检验，进一步两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、血压比较 见表1。共有51只大鼠造模成功，各组间体质量、收缩压差异有统计学意义（P＜0.05），舒张压差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，模型组体质量及收缩压均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，中药高剂量组、阿托伐他汀组收缩压均显著降低（P＜0.05），中药高、中剂量组及阿托伐他汀组体质量均显著降低（P＜0.05）。与阿托伐他汀组比较，中药高剂量组收缩压降低（P＜0.05），体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠体质量、血压比较

2.2 各组大鼠动脉内膜损伤的病理变化比较 正常组：主动脉标本内膜多光滑平整，镜下见内皮细胞呈扁平状，平滑肌细胞呈长梭形状且排列整齐，细胞核大小均匀，细胞膜及核膜清晰完整，浆内染色均匀，胞内未见泡沫状改变，管壁无脂质沉积，管腔未见明显狭窄。模型组：主动脉内膜明显增厚，镜下见平滑肌细胞排列欠整齐，胞内大量泡沫细胞聚集，泡沫细胞体积较大，胞质内含有大量空泡，从而导致管腔明显狭窄。中药低剂量组：大鼠腹主动脉内膜镜下表现与模型组大致相近。中药高、中剂量组及阿托伐他汀组：主动脉内膜局部可见轻度增厚，并能够看见少许泡沫样改变，部分管腔有少许狭窄，但其病变程度均轻于模型组。见图1。

图1 各组腹主动脉标本动脉内膜损伤病理变化（HE染色，200倍）

2.3 各组大鼠血脂相关指标比较 见表2。各组间TC、TAG、HDL-C、LDL-C水平及AIP差异均有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组TC、TAG、LDL-C水平及AIP均显著升高（P＜0.05），HDL-C显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，中药高剂量组TC、TAG、LDL-C水平、AIP均显著降低（P＜0.05），HDL-C水平均显著升高（P＜0.05）；阿托伐他汀组TC水平显著降低（P＜0.05），TAG、LDL-C、HDL-C水平、AIP差异无统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血脂指标比较（±s）

表2 各组大鼠血脂指标比较（±s）

组别正常组模型组阿托伐他汀组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组n 9 8 9 8 8 9 TC（mmol/L）0.53±0.14*1.07±0.22 0.83±0.18*0.81±0.11*0.79±0.16*0.94±0.12 TAG（mmol/L）0.41（0.30，0.44）*0.80（0.72，0.92）0.68（0.51，0.74）0.49（0.44，0.53）*0.56（0.41，0.61）0.82（0.60，1.02）HDL-C（mmol/L）0.39±0.01*0.25±0.64 0.31±0.05 0.37±0.53 0.34±0.05 0.29±0.04 LDL-C（mmol/L）0.13±0.02*0.50±0.10 0.32±0.11 0.22±0.12*0.30±0.12*0.44±0.15 AIP 0.00（-0.45，0.05）*0.54（0.38，0.64）0.35（0.22，0.38）0.10（0.08，0.18）*0.24（0.04，0.28）*0.47（0.26，0.56）

2.4 各组大鼠肝组织miR-613、LXRα mRNA表达量比较 见表3。各组间miR-613、LXRα mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组大鼠miR-613 RNA表达明显升高，LXRα mRNA表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药高、低剂量组、阿托伐他汀组miR-613 RNA表达均显著降低，LXRα mRNA表达显著升高（P＜0.05）；阿托伐他汀组与中药高剂量组miR-613及LXRα mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠肝组织miR-613、LXRα mRNA表达量比较（±s）

表3 各组大鼠肝组织miR-613、LXRα mRNA表达量比较（±s）

组别正常组模型组阿托伐他汀组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组n9 8 9 8 8 9 miR-613 1.10±0.31*4.52±0.74 1.59±0.27*1.72±0.74*2.23±0.81*4.61±0.61 LXRα 0.87±0.28*0.46±0.31 0.78±0.19*0.80±0.10*0.71±0.17*0.52±0.22

3 讨论

AS作为心脑血管缺血性疾病的中心环节，目前发病机制尚未明确，脂质浸润学说、内皮损伤-反应学说、血小板聚集和血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说都是广为接受的经典学说[1]。有文献指出，血管内皮炎症反应会导致血脂异常冠心病的血管内皮组织损伤[9]，伴有胰岛素抵抗可能与阿司匹林抵抗进而诱发动脉粥样硬化性缺血事件[10]。故可能上述几种学说对于AS的发生发展存在复合作用，目前亦未存在药物能同时针对多种机制。

本团队负责人陈伯钧教授认为，AS作为一种慢性疾病，病位在心、肝、脾胃、脑，病因主要为饮食不慎、劳逸失衡，痰瘀为重要病理因素及病理产物，主要核心病机为气滞痰瘀，治法为疏肝行气，健脾化痰，活血化瘀。疏肝温胆汤取柴胡疏肝散合温胆汤，方中柴胡、芍药、枳实、甘草为伤寒四逆散组成，合白芍酸甘养阴，敛阴和血活血，疏肝和血行气，旨在以肝为切入点，恢复机体正常气机；半夏、陈皮、竹茹、茯苓为二陈汤主要组成，可燥湿健脾化痰，旨在以脾胃为切入点，祛除痰湿病邪；再合丹参，养血、活血、祛瘀、清心，旨在祛除瘀血病邪。全方共奏疏肝行气、健脾化痰、活血化瘀之功，标本兼顾，扶正祛邪。

本项研究，通过免疫损伤合并高脂饲料诱导、束缚情志应激法构建AS大鼠模型，造模后发现AS大鼠腹主动脉内膜病理镜下见内膜明显增厚，管腔明显狭窄，这与多项AS相关动物实验结果一致[11-13]。本实验证实：疏肝温胆汤能明显改善AS大鼠的腹主动脉内膜病理改变，同时证实疏肝温胆汤能明显降低TC、TAG、LDL-C水平及AIP，提高HDL-C水平。其中高剂量疏肝温胆汤对TAG、LDL-C、HDL-C及AIP的作用优于阿托伐他汀，与既往研究结论一致[14-15]。

mirco-RNA（miR）作为上游因子靶向针对多个mRNA，进而调控机体多种生理活动及介导多种病理生理进程。文献指出，miR-126、miR-210、miR613等miR的表达异常通过影响内皮功能、脂类代谢等促进AS的发生发展[16-18]，可能成为治疗AS的上游靶点。而多项中药、中成药针对脂类代谢的临床试验证实，上调LXRα可改善血脂[19-20]。本次实验结果证实疏肝温胆汤能显著下调miR-613的mRNA表达、上调LXRα的mRNA表达。本次实验上调LXRα的mRNA表达的结论与其他学者温胆汤变方对于LXRα作用的研究结论一致[21]。而miR-613的mRNA表达降低、LXRα的mRNA表达升高，也符合Ou Z对于miR-613与LXRα之间负反馈调控的结论[7]。目前暂无药物调控miR-613的文献报道。

结合本次研究结果及相关文献，疏肝温胆汤可以延缓大鼠动脉粥样硬化进程，可能通过下调miR-613的表达、上调LXRα的表达进而影响血脂代谢实现。本团队后续也将展开基于miR-613/LXRα通路探讨疏肝温胆汤对于AS的作用机制研究，以明确疏肝温胆汤延缓AS进展的作用机制，为疏肝温胆汤治疗AS提供了更扎实的理论基础。