芪归银方治疗脓毒症机制的网络药理学研究*

杨亮亮 刘清泉

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；3.北京市中医研究所，北京 100010）

脓毒症是引起全身炎症反应综合征的最急性、危 重的疾病并发症之一，通常由各种微生物引起，如细菌、真菌等。脓毒症能引起多器官损伤和（或）衰竭[1]。它是导致脓毒症患者发病和死亡的主要原因，尤其是年长者和危重症患者[2-3]。全世界脓毒症发病率每年都在增加[4-5]，有报道称脓毒症的发病率约为1/1 000人，在中国脓毒症住院死亡率约为48.7%[6]。

芪归银方是首都医科大学附属北京中医医院刘清泉教授根据细菌感染性病症创建的中药复方，以扶正透邪为法，临床应用于感染性疾病及脓毒症的治疗。但鉴于中药复方成分繁杂，运用传统科学研究手段仍无法全面阐述其复杂的物质基础和分子机理，本研究采用了网络药理学手段，通过建立芪归银方药材-成分-靶点-病理相互作用网络，研究了芪归银方治疗脓毒症的药效物质基础和作用机制。

1 资料与方法

1.1 芪归银方的有效药物成分筛选 将组成芪归银方的各药物输入中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中[7]，检索芪归银方剂中的全部药物活性成分。以“化合物口服生物利用度（OB）≥30%”和“化合物类药性（DL）≥0.18”为条件筛选芪归银方的各药物活性成分，对于不符合OB和DL筛选条件的成分结合查阅文献予以补充，避免遗漏重要药物成分。

1.2 药物有效活性成分靶点预测 将有效活性成分导入 SwissTargetPrediction数据库系统（http：//www.swisstargetprediction.ch/）[8]检测有效活性成分的作用靶点，将靶点导入UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）[9]规范名称。

1.3 脓毒症疾病靶基因的筛选 利用TTD数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Drug bank 数据库（https：//www.drugbank.ca/）和 DisGeNET 数据库（https：//www.disgenet.org/），关键词“sepsis”，找到与脓毒症发病相关的靶基因[10]。把3个数据库中检索到的靶基因在Excel软件中取并集，去除重复值，以靶基因与疾病之间的相关度为依据，从高到低排序，筛选出了相关度排名在前列的253个靶基因。

1.4 药物与疾病交集靶点数据库及网络图的构建将筛选出的方剂靶基因和脓毒症疾病靶基因使用Excel软件进行合并，提取交集靶基因，得到芪归银方治疗脓毒症的交集靶基因数据。利用Cytoscape软件绘制“药物-活性成分-疾病基因”网络。

1.5 靶点相互作网络的构建与关键节靶点的筛选将筛选后获得的芪归银方脓毒症的交集靶基因，输入String数据库系统（https：//string-db.org/）[11]以分析蛋白质之间的相互作用。将得到的疾病靶基因PPI结构图导入Cytoscape3.7.2中，使用“Notework Analyzer”工具拓扑分析PPI网络，指标为节点连接度，筛选出前30个关键节点构建核心靶点相互作用图。

1.6 芪归银方治疗脓毒症相关靶点的富集分析 将芪归银方治疗脓毒症的潜在靶点导入Metascape数据库（https：//metascape.org/）中进行 KEGG 信号通路和GO生物过程富集分析，以P＜0.01为临界值，通过筛选得到芪归银方治疗脓毒症的KEGG信号通路和GO生物过程，利用 bioinformatics（http：//www.bioinformatics.com.cn）获取可视化结果。

2 结果

2.1 有效活性成分筛选 在TCMSP数据库中检索到芪归银方总计636种药物活性成分，其中黄芪87个，当归125个，金银花236个，青蒿126个，虎杖62个。筛选出黄芪20个，当归2个，金银花22个，青蒿22个，虎杖7个共73个有效活性成分，去除6个重复的成分，剩67个有效活性成分。

2.2 有效活性成分靶点与疾病靶点预测 通过SwissTargetPrediction数据库预测靶点，得到有效活性成分作用靶点共有7 052个，其中黄芪2 000个、当归200个、金银花1 924个、青蒿2 100个、虎杖828个，去掉共同靶基因后有922个靶点。通过Swiss Target Prediction得到75个药物与疾病交集靶基因，构建芪归银方治疗脓毒症的靶基因数据库。

2.3 构建中药-成分-靶基因网络图 使用Cytoscape3.7.2软件建立药物-成分-靶基因的网络图，见图1。深蓝色菱形代表靶基因；淡绿色圆形代表药材，六边形表示药材的有效活性成分，粉色六边形代表黄芪的活性成分，橙色六边形代表青蒿的活性成分，紫色六边形代表金银花的活性成分，墨绿色六边形代表虎杖的活性成分，淡黄色六边形代表几种药物的共有活性成分。

图1 中药-成分-靶基因网络图

2.4 构建蛋白互作网络图及其核心靶点的筛选 将交集靶点导入String数据库并分析得出蛋白相互作用图（PPI），节点为靶基因，“边”是与靶基因作用，共有75个节点、646条边，见图2。分别算出网络图中各个靶基因Degree，利用degree计算可以得到重要的脓毒症关键蛋白质作用靶点，按Degree数值排序，前30位的核心节点分别为TNF、MAPK3、ALB、MAPK1、CASP3、STAT3、TLR4、MMP9、NOS3、ICAM1、MPO、MTOR、RELA、MMP2、SIRT1、SERPINE1、HIF1A、JAK2、CTNNB1、HMOX1、TLR9、EP300、CASP8、F2、PIK3R1、CASP1、NLRP3、NR3C1、ELANE、CXCR2。

图2 芪归银方治疗脓毒症的蛋白质-蛋白质相互作用网络

2.5 GO生物功能注释 将芪归银方对脓毒症治疗的99个潜在靶点进行富集分析，以P＜0.01为筛选要求，得到1 730条GO生物学过程，其中分子功能90条、生物过程1 576条、细胞组成64条（见图3）。取P值最低的10个条目注释（见表1），潜在靶点在生物过程中主要富集于细胞迁移的正向调节、细胞运动的正向调节、创伤修复、凋亡信号通路、炎症反应的调节等；分子功能中主要富集为肽链内切酶活性、肽酶活性等；在细胞组成中主要富集条目为膜筏、膜微结构阈等。

图3 芪归银方治疗脓毒症的GO富集分析

表1 芪归银方治疗脓毒症的GO生物功能注释（前10名）

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG富集分析（P＜0.01），得出252条芪归银方治疗脓毒症的信号通路。按照从小到大的次序对P值进行排列，并取P值最小的前20个通路进行分析（见表2）和得到可视化结果，见图4，节点越大代表富集基因数量就越多，颜色越红代表富集越明显。共同靶点主要富集在癌症、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等疾病及HIF-1信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、血小板活化信号通路等信号通路上。

图4 芪归银方治疗脓毒症的KEGG分析气泡图

表2 芪归银方治疗脓毒症的主要作用靶点KEGG富集结果（前20位）

3 讨论

芪归银方是刘清泉教授在细菌感染疾病的病机基础上，以扶正透邪为法研究创建的方剂，在临床上主要用来防治感染性疾病和脓毒症[12]。芪归银方药物组成：黄芪、当归、金银花、虎杖、青蒿。黄芪、银花、当归3味药为本方的主体。气与血在机体中是互根互用，互为因果的关系，气为血之帅，血为气之母，气盛则血充；血液的运行亦离不开气的推动作用，气虚气滞，都会导致血瘀，气的充盈且气机调畅可以推动血液在体内的畅通循环运行。黄芪为补气的圣药，方中大量运用黄芪为君药健脾补气，补益体内元气，以滋养生血之源，并与血中气药当归配伍，气药、血药合而为用，血得气速生；另一方面，气旺则血行，气的推进是血液运行的动力，气的温煦功也能促进血液的运行，黄芪与当归合用，补气生血，行血活血，使补而不滞，疏而不损，很好的印证了西医免疫与凝血系统的相互作用关系。

本研究结果显示，芪归银方防治脓毒症的重要靶点和重要通路，主要参加了炎症和凝血的过程。

脓毒症是机体炎症反应失衡的结果，在早期由于大量炎症因子释放后作用于机体的主要脏器，从而造成了器官功能不全，同时由于巨噬细胞介导炎性介质参与固有免疫和适应性免疫应答，产生了炎症介质瀑布效应，最后造成脓毒症休克和多器官功能衰竭[13]。脓毒症致病过程的核心通路是核转录因子-κB（NF-κB）[14]。NF-κB参与脓毒症的病理生理的主要机制，调节了大量炎症介质基因的表达[15]。低氧诱导因子（HIF）能激活NF-κB[16]。AGEs和RAGE作用后能够引起氧化应激，从而激活p38 ras蛋白和丝裂原活化蛋白（MAP）激酶激活NF-κB，NF-κB的活化可以使一氧化氮（NO）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞克隆刺激因子等炎症因子以及VCAM-1、ICAM-1等分泌增加，同时大量炎性细胞因子、生长因子和黏附分子的表达释放能引发瀑布式炎症反应，形成恶性循环，并持续导致机体功能失调和细胞破坏，从而引起组织器官损害的产生[17]。首先，芪归银方可能通过作用于HIF-1信号通路及AGE-RAGE信号通路调节其下游的NF-κB信号通路，使其活性降低，减少NF-κB在脓毒症发病过程中介导IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子的释放，阻断了“炎症瀑布”的形成。方中君药黄芪的主要成分为黄芪总皂苷，被证明能降低性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脾脏组织和血清中IL-1β的表达，升高IL-10的表达，通过调控促炎和抗炎因子水平，调节机体的炎性反应微环境[18]。既往动物实验表明芪归银能影响IL-1β及TNF-α血清浓度，有效调节机体炎性免疫应答，可以通过抑制炎症反应使自噬减少，使脓毒症急性肾损伤得到改善[19-20]。

其次，芪归银方可能通过作用于血小板活化通路发挥双向调节作用，芪归银方与脓毒症的核心靶点TLR4可以促进血小板的活化和释放，是介导血小板活化通路的模式识别受体[21]。此外，芪归银方的核心靶点MAPK介导的丝裂原活化蛋白激酶通路已被证实与血小板颗粒分泌有关[21]。血小板活化在脓毒症产生和进展过程中有着重要意义，血小板活化后在脓毒症中将发挥双重作用，首先，血小板活化后可通过激活凝血系统及参与免疫应答和炎症反应限制血液中病原体的播散，从而协助吞噬细胞吞噬并分解病原体；但是活化后的血小板却可以通过多种机制导致凝血功能失调、免疫功能失衡及炎性反应过度，损害机体器官功能，导致脓毒性休克和MODS[22]。脓毒症发生时，内皮细胞损害及炎症、凝血反应均会激活血小板，当血小板被激活后又与炎症介质和内皮细胞相互作用，进而加重凝血功能紊乱和全身炎性反应，从而形成恶性循环，导致机体发生严重的微循环功能障碍和器官功能损害[23]。血小板还参与了多种免疫过程，有证据表明血小板参与了：1）对微生物威胁的干预；2）招募和促进固有效应细胞功能；3）调节抗原提呈；4）增强适应性免疫反应，并表达多种功能性免疫受体，使其在有效地与其他细胞沟通和调节其功能方面发挥重要作用，并在调节免疫方面执行哨兵任务[24]。

降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）是临床常用的感染相关性指标，其中PCT具有高敏感性和高特异性，CRP敏感性较高而特异性较低，课题组临床实验结果[25]显示芪归银方联合抗生素可以减轻脓毒症心肌抑制患者的炎症反应，在常规应用抗感染药物的同时，加用芪归银方组患者PCT显著下降出现在第3天，CRP显著下降出现在第7天，治疗7 d后两组患者的PCT、CRP及肌钙蛋白I（cTnI）、肌钙蛋白T（cTnT）均较治疗前明显下降，两组患者治疗7 d后的CRP及cTnT出现显著差异，相比于对照组，芪归银颗粒可以加速炎症因子的清除，与芪归银方能调节脓毒症患者机体炎症反应过程的网络药理结果相互印证。

炎症与凝血系统是机体完成生命活动主要的生理、病理系统，它们之间既彼此独立又存在着复杂的相互作用，其中任何一个系统功能失调，都可能引发一系列级联放大反应，导致机体出现错综复杂的病理性改变[26]。通过本研究发现芪归银方治疗脓毒症的机制可能是通过潜在靶点和HIF-1、AGE-RAGE及血小板活化信号通路调节炎症和凝血间的相互关系治疗脓毒症的，本研究首次发现了芪归银方能够作用于血小板活化通路，可能通过血小板活化通路发挥双向调节作用，为后续研究芪归银方通过调节炎症与凝血相互作用关系治疗脓毒症开辟了新的研究方向，还需在此基础上开展深入探究，并进行体内外实验验证。