关于当归炮制后新产生成分如何分离及结构鉴定

刘伟

中药当归是临床上应用较为普遍的补血药物,其味甘、性辛温,可归肝、心、脾经,入药后能够发挥良好的补血效果,其不仅在血虚所致的多种症状中发挥效果,同时也能发挥活血、止痛、补血等功效,为妇科调经治疗的首选药物［1］。炮制则是现阶段应用十分广泛的一种中药临床用药手法,当前临床上当归炮制品应用种类繁多,其中较为常见的炮制品包含生当归、酒当归以及土炒当归等多种类型［2］。中药炮制主要是一种依据中医临床用药需求及药物自身性状,并结合调剂、制剂方法的差异对药物进行加工处理的制药技术［3］。对于当归炮制后成分的鉴定与明确则是确保其临床用药安全性的重要手段,但在采取不同炮制方法的情况下,其临床效果也有一定差异,新产生成分的化学成分也不一样,这对于临床用药药物的药性研究十分关键,且单单依据气味、颜色难以辨别,故为了有效确保其使用效果及安全性,采取合理手段明确当归炮制后新产生的成分十分重要［4,5］。对此,本文主要分析当归炮制后新产生成分的分离方式及结构鉴定。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 研究中选取仪器试剂主要为核磁共振仪(产自瑞士；AVANCE Ⅲ；500 MHz)；液相色谱仪(产自美国Asi-lent；Agilent1200)；制备型高效液相色谱仪(产自美国Asi-lent；Agilent1100)。研究中应用材料主要包含柱层析硅胶(产自青岛海洋化学厂；100-200 目、200-300 目)；当归生品(产自浙江中医药大学中药饮片厂)。

1.2 方法

1.2.1 当归炮制前后图谱对比 针对此次研究中生当归炮制后新产生成分主要经高效液相色谱法(HPLC)图谱发现,当归炮制过程如下：称取40%干燥60 目生品当归及1 g 制品粉末,将其置于圆底烧瓶(50 ml)中,注入50 ml 甲醇(CH4O)在水浴(80℃)环境下回流60 min,抽滤并使用10 ml CH4O 分次对瓶壁及滤渣进行洗涤,此后合并滤液,减压浓缩；针对残渣使用CH4O 溶解,并将其定容到容量瓶(5 ml),从而得到当归生品及制品样品。使用微孔滤膜(0.22 µm)进行过滤,取续滤液,予以10 µl 进样,并进行HPLC 分析,得到色谱图如图1(炮制前)、图2(炮制后),对比炮制前后色谱图可见,色谱峰1、2 为炮制后新得到的产物。

1.2.2 提纯分离 制取4 kg 当归,加入95%的乙醇(EtOH)60 kg(当归的15 倍量)；加热回流提取2 次,提取时间为90 min/次,提取液回收至无醇味,加入水适量以分散,并分别应用石油醚(C7H16)、乙酸乙酯(C4H8O2)和正丁醇［CH3(CH2)3OH］进行萃取,C4H8O2萃取物(80 g)通过硅胶柱色谱,使用C7H16-C4H8O2梯度洗脱,得到洗脱部位1、2,前者应用制备液相(H2O-CH4O 为流动相)分离,获得化合物A；后者采取重结晶分离,获得化合物B 与C。

2 结果

2.1 化合物A 经观察鉴定,化合物A 为微黄色油状物,经10%的硫酸(H2SO4)显色(于硅胶薄层板上)后,呈墨绿色。具体色谱资料见表1。结合波谱数据及相关文献研究显示,化合物A 与5-HMF 高度一致,故鉴定为5-HMF。分离后结合相同色谱条件进行高效液相分析,显示图2 色谱峰2 为5-HMF。

表1 化合物A 色谱分析结果

2.2 化合物B 化合物B 为白色针状结晶(CH4O),经溴甲酚(C21H14Br4O5S)绿反应呈现阳性,提示可能含有羧基；经三氯化铁(FeCl3)反应呈现阳性,显示可能存在酚羟基。具体色谱资料见表2。结合上述理化性质及波谱数据分析可见,该化合物结构与香草酸(C8H8O4)高度一致,故分析其为香草酸。

表2 化合物B 色谱分析结果

2.3 化合物C 化合物C 表现为白色结晶,通常为针状,其于溴甲酚绿(C21H14Br4O5S),发生化学反应后,呈现阳性,故表明存在羧基。ESI(+)-MS 得出结果(m/z124［M+H］+)。则表明分子中有C=O；80［M+HCO2］则表明分子中存在-COOH。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)谱给出质子信号5 个,峰形较宽,结合色谱显示可能为羰基信号,推测为羧基氢信号；9.114 为吡啶环上连接杂原子的碳上质子信号；8.854、8.303、7.573构成吡啶环上3 个相邻质子偶合系统。C-NMR 谱给出碳信号6 个,δ166.35 为羧基碳信号,其余5 个位连接杂原子的碳信号。结合上述分析可推断该化合物的构成为连接1 个吡啶环、1 个羧基。结合上述理化表现及波谱数据显示其与烟酸(C6H5NO2)基本一致,故分析化合物C 为烟酸。

3 讨论

当归是中医临床上应用较为普遍的一味中草药,其为多年生草本植物,主要产自甘肃东南部［6］,多用于中医治疗,具有极高的药用价值,临床上多将其应用于心脏、心血管等疾病的治疗中,具备抗氧化、抗炎症及抗血小板聚集等多种功效［7］。目前,临床上主要通过中医炮制形式对当归的功效进行明确,从当归炮制方式来看,临床上主要有酒当归、当归炭及当归土炒等形式［8］。相关研究资料显示,当归中包含的水溶性及挥发性物质是其主要成分,水溶性成分多为阿魏酸,挥发性成分主要为挥发油及总鞣质等［9］。同时也有相关研究显示,采取不同的方法进行炮制后得到的药品质量也存在一定的差异,并对其成分质量有一定影响［10］。目前在当归中包含的已知化合物主要包含香草酸与烟酸,而5-HMF 则是当归炒制中产生的一种新成分［11］；在当归中包含糖,故在其处于酸性环境及高温条件下则会导致多糖水解为单糖,进一步处于酸性环境下则会脱水形成5-HMF。经分离得到的5-HMF进一步纯化后,经薄层色谱法(TLC)、HPLC 检查可见,其含量高于98%［12］。结合此次研究分析可见,在当归炒制后共产生新物质为2 种化合物,通过分离提纯得到其中一个为5-HMF,另一个未能得到,经HPLC 色谱图分析可见,其出峰时间早于5-HMF,这显示其对比5-HMF 的极性更大,结合图谱及理化分析可见,其可能含有羟基、羰基。既往有研究人员发现,在中药材何首乌进行炮制后,新产生了两种化合物,经分离提纯后鉴定显示其一为5-羟基麦芽酚,其二为5-HMF。在HPLC 色谱中显示5-羟基麦芽酚对比5-HMF 出峰时间更早,经质谱得出其分子量为144。结合这一研究认为分离得到的两种物质可能为麦拉德反应产物,即为单糖与蛋白质或氨基酸在某种条件下经一系列化学反应及结构转化形成的新产物。故分析在当归炮制后产生的新增化合物可能为5-羟基麦芽酚,但具体产物分析还有待进一步深入探析。

综上可见,在当归炮制后得到的产物主要有3 种,即为5-HMF、香草酸与烟酸,其中5-HMF 为当归炮制后得到的新化合产物之一,而针对实验中产生的另一新产物仍需进一步研究加以鉴别。