补肾化痰复方对多囊卵巢综合征大鼠的作用机制研究

蔡昭炜 何少娟 刘容菊 刘华桢

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄妇女最常见的生殖内分泌代谢紊乱疾病之一［1］。PCOS 的临床表现与高雄激素血症密切相关,同时受多个信号通路及生物机制的调控,如PI3K/AKT 等［2,3］。大量研究已经证实,PCOS 是与胰岛素抵抗(IR)存在密切关系的临床综合征［4］,在机体发生胰岛素抵抗时,某些相关信号通路被抑制,随后产生一系列生物反应致使葡萄糖上升。补肾化痰复方是由黄茂、仙灵脾、苍术、茯苓、丹参、黄连由组成,可用来补肾阴阳、化痰软坚,主治下丘脑-垂体功能失调而卵巢略大的闭经［5］。目前的研究已显示该方不仅具备补肾化痰等功能,还具备降血糖、改善卵巢异常症状等功能［6］,尽管这样,其中通路和机理具体的联系和效果作用仍需要科研的继续探索证实。卵巢颗粒细胞的增殖是多囊卵巢综合征内分泌代谢紊乱的首要特征［7］,卵巢颗粒细胞的活跃状态直接表现了其病症的严重程度,经文献和前期研究发现,补肾化痰复方中药单体能通过抑制相关通路诱导大鼠卵巢颗粒细胞凋亡［8,9］,这也就说明了该方或许能够影响大鼠卵巢颗粒细胞的增殖情况,通过调控卵巢颗粒细胞的增殖减缓PCOS,其具体的作用效果和生物机制需要进一步的研究。本实验通过补肾化痰复方干预PCOS 大鼠模型,观察补肾化痰复方对大鼠内分泌相关生化指标水平变化、胰岛素抵抗以及大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响,探究补肾化痰复方是否能够通过调控胰岛素分泌以及抑制卵巢颗粒细胞增殖对PCOS 大鼠产生积极的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 采用阴道涂片筛选出80 只动情周期正常的雌性大鼠,均为SPF 级SD 大鼠,7～8 周龄,体重180～200 g,购自广东省医学实验动物中心,该实验所有处理方法均经过伦理委员会批准。采用随机数字表法将大鼠分为Ctrl组、PCOS组、低剂量组、高剂量组,每组20 只。

1.2 方法 ①模型构建：所有动物均喂饲普通饲料,正常饮水。每天早上9 点灌胃1 次,PCOS组、低剂量组、高剂量组建立PCOS 大鼠模型,采用来曲唑联合高脂乳剂灌服,造模连续28 d；Ctrl组采用同种方式加入等体积蒸馏水。②干预方式：造模成功后,低剂量组、高剂量组分别给药补肾化痰复方60、120 mg/kg,PCOS组、Ctrl组采用同种方式加入等体积蒸馏水。③检测方法：实时监测各组大鼠游离脂肪酸、黄体酮、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平；通过监测各组大鼠禁食180 min 血糖变化检测其胰岛素耐量；利用CCK-8 测定各组大鼠卵巢颗粒细胞增殖情况。

CCK-8 测定各组大鼠卵巢颗粒细胞增殖情况具体操作：卵泡液的收集和颗粒细胞的纯化方法以密度梯度离心法为基础,具体步骤如下：①严格遵照正确取卵方式,通过穿刺方式得到卵母细胞-放射冠细胞-卵丘细胞复合体,接着整理保存依附着卵巢颗粒细胞的卵泡液；②卵泡液分离：2000 r/min,10 min,半径11.6 cm,去除上部分液体；③余下液渣和絮乱物则是1 ml 浓度为0.2%的透明质酸酶重悬,37℃水浴温热20 min；④沉淀物捏聚,并小心稳定地转移到已备好的15 ml 无菌离心管,离心管已做好预备工作(加入4 ml淋巴细胞分离液),2000 r/min,10 min,半径11.6 cm；⑤中央白灰色固态悬浮物细胞团便是颗粒细胞,用针管抽取到1.5 ml 离心管中,再用1×PBS 溶液清洗1 遍,-80℃永久保存。收集上述细胞后,进行试验的分组：正常组、补肾化痰复方低、中、高组。正常组给予含0%含药血清RPMI-1640 完全培养液培养48 h,补肾化痰复方低、中、高组分别给予浓度为含20%、40%、80%含药血清的培养液,培养48 h。将培养后的PCOS大鼠卵巢颗粒细胞(104个细胞/孔)接种到96 孔板中,然后用不同浓度的PB2 (0、10、20、50、100 μM)处理48 h。接下来,依照CCK-8 法来进行细胞增值活性程度计算。将10 μl CCK-8 溶液转移至96 孔板的所有板孔。温育3 h,经酶标仪450 nm 检测细胞反应强度。

1.3 观察指标 比较四组大鼠游离脂肪酸、黄体酮、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平；禁食不同时间后ITT值；不同剂量补肾化痰复方组大鼠卵巢颗粒细胞增殖情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用单因素方差分析或秩和检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠游离脂肪酸、黄体酮、TC、TG、LDL-C和HDL-C 水平比较 PCOS组大鼠黄体酮、HDL-C 水平显著低于Ctrl组,游离脂肪酸、LDL-C、TC、TG 水平高于Ctrl组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。低剂量组黄体酮高于PCOS组,游离脂肪酸、LDL-C 低于PCOS组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；低剂量组TC、HDL-C 和TG 水平与PCOS组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。高剂量组黄体酮、HDL-C 水平高于PCOS组,游离脂肪酸、LDL-C、TC、TG 水平低于PCOS组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1,图1～4。

表1 四组大鼠游离脂肪酸、黄体酮、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平比较()

表1 四组大鼠游离脂肪酸、黄体酮、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平比较()

注：与Ctrl组比较,aP＜0.05；与PCOS组比较,bP＜0.05

2.2 四组大鼠禁食不同时间后ITT 值比较 四组大鼠禁食不同时间后ITT 值比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；禁食30 min,四组大鼠ITT 值均下降,低剂量组、Ctrl组大鼠ITT 值下降到最低值,而PCOS组则是禁食60 min 才达到最低值,之后开始增高；高剂量组禁食90 min ITT 值达到最低值,之后开始增高。在相同时间点,PCOS组大鼠ITT 值均高于Ctrl组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；高、低剂量组ITT 值与Ctrl组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；且高剂量组的ITT 值随时间的变化幅度相较于低剂量组而言更小。见表2,图5。

表2 四组大鼠禁食不同时间后ITT 值比较(,mmol/L)

表2 四组大鼠禁食不同时间后ITT 值比较(,mmol/L)

注：与Ctrl组比较,aP＜0.05

2.3 不同剂量补肾化痰复方组大鼠卵巢颗粒细胞增殖情况比较 0 μM组、10 μM组、50 μM组和100 μM组大鼠卵巢颗粒细胞相对活性分别为(91.00±11.36)%、(63.33±8.74)%、(53.00±11.79)% 和(41.00±14.11)%,比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；10 μM组、50 μM组和100 μM组大鼠卵巢颗粒细胞相对活性明显低于0 μM组,差异具有统计学意义(P＜0.05),并且随着剂量梯度升高,下降越显著。见图6。

3 讨论

补肾化痰复方是结合中医妇科理论所总结的治疗脾肾阳虚痰湿型PCOS 的经验方。前期的研究和大量文献证明,补肾化痰复方与PCOS 大鼠的信号通路相关,并且经通路调控胰岛素分泌和抑制卵巢颗粒细胞增殖,对PCOS 有着积极的缓解作用［10-12］,但这些方面目前没有动物实验证实。

PCOS 是国内研究的重心,近年来国内越来越多的研究人员倾向将中医辨证思想融入顽疾的诊治中,而国外却鲜有用中药治疗PCOS 的实验或研究。本实验首次证明了PCOS 大鼠在补肾化痰复方的干预下,血清中的游离脂肪酸、黄体酮水平、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 异常表达均得到缓解。在PCOS 大鼠中,黄体酮水平、HDL-C 和TG 的表达水平异常低,而游离脂肪酸水平、LDL-C 和TC 的水平异常高,说明了PCOS影响了大鼠的内分泌情况,使大鼠的多项生化指标处在一个异常的情况。而在补肾化痰复方的干预下,这些生化指标均向正常大鼠的标准值靠近,这说明了补肾化痰复方缓解了PCOS 内分泌的异常,使游离脂肪酸、LDL-C、TG 和TC 分泌降低,黄体酮、HDL-C 分泌增加。证实了补肾化痰复方可能有调整大鼠内分泌稳定的效果［13,14］。而在本实验的胰岛素耐量研究中,证实了补肾化痰复方显著改善了PCOS 大鼠的胰岛素耐量,具体表现为补肾化痰复方组的ITT 值随时间的变化趋势相较于PCOS组更稳定。这说明了PCOS 影响了大鼠的胰岛素抵抗能力,使胰岛素耐量处于不稳定的状态,而补肾化痰复方能够改善PCOS 大鼠的胰岛素抵抗异常情况。补肾化痰复方调控胰岛素分泌缓解PCOS 的理论具有极大可能,但确切的证明仍需要进一步研究。卵巢颗粒增殖情况与补肾化痰复方的关系也在本实验中被证实,在不同浓度的补肾化痰复方干预下,PCOS 大鼠的卵巢颗粒增殖得到明显抑制。证实了抑制卵巢颗粒细胞增殖活性极可能是补肾化痰复方缓解PCOS 的途径之一,但具体的证明也需要下一步的研究。

综上所述,大鼠患上PCOS 后体内激素分泌异常、生理行为异常、胰岛素分泌不足,导致卵巢颗粒增殖行为异常活跃,而补肾化痰复方可能通过调控胰岛素分泌改变其胰岛素抵抗情况,并通过抑制其卵巢颗粒细胞增殖来改善生理活动异常。补肾化痰复方在PCOS中发挥着很大的作用,作为其特效药有潜在的可能性和巨大的研究价值,以调控胰岛素和抑制卵巢颗粒细胞治疗PCOS 有一定的可行性,其具体作用机理有待研究。