外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞水平预测早期卵巢癌患者腹腔镜术后淋巴结转移分析*

曾海荣，黄 丹，张建军，华海琴

儋州市人民医院：1.健康体检部；2.检验科；3.肿瘤科，海南儋州 571700

手术是治疗早期卵巢癌(OC)患者重要手段，可有效切除病灶，降低肿瘤负荷，提高患者生存时间[1]。腹腔镜手术因具有无创、恢复快等优势被广泛用于OC手术中，成为开腹手术外，治疗早期OC的有效术式[2]。尽管早期OC患者经腹腔镜手术治疗后生存时间得以延长，但术后淋巴结转移风险仍较高，增加病死风险，导致不良预后[3-4]。因此，寻求可早期预测早期OC患者术后淋巴结转移风险新型指标十分必要。研究发现，OC发生、发展不仅与细胞增殖及侵袭等有关，还与患者免疫调节功能失调存在密切联系[5]。淋巴细胞亚群在维持机体免疫平衡中具有重要作用，CD8+T淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞，主要功能是直接杀伤靶细胞，对辅助T淋巴细胞及B淋巴细胞免疫调节具有抑制作用，进而抑制细胞免疫形成[6]。自然杀伤细胞(NK)是机体重要免疫细胞，与抗肿瘤、免疫调节等有关，可识别靶细胞、杀伤介质[7]。结合NK、CD8+T淋巴细胞机制及免疫与OC关系，推测NK、CD8+T淋巴细胞可能与早期OC患者发展有关，目前关于NK、CD8+T淋巴细胞与早期OC患者术后淋巴结转移关系的具体结论尚未证实，本研究主要观察外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞在早期OC患者中表达，并分析二者对预测早期OC患者腹腔镜手术后淋巴结转移的价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2016年3月至2018年3月本院收治完成腹腔镜手术后3年内发生淋巴结转移的40例早期OC患者病历资料，设为转移组；另收集同期本院收治完成手术后3年内未发生淋巴结转移的40例早期OC患者资料，设为未转移组；两组患者年龄、疾病类型、合并基础疾病等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。具有可比性。见表1。

1.2入选标准

1.2.1纳入标准 (1)OC符合《卵巢恶性肿瘤诊断与治疗指南(第四版)》[8]中诊断标准，且经体格检查、实验室检查、病理组织学检查等确诊；(2)均为早期OC，无明显症状，患者临床分期[9]为Ⅰ期(肿瘤局限于卵巢)或Ⅱ期(一侧或双侧卵巢肿瘤，伴盆腔内扩散)；(3)患者均在本院完成腹腔镜手术治疗，且术后获得随访结果，随访时间为3年；(4)患者临床资料完整，资料中包含本次研究所需基线资料及重要实验室指标，如外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞水平；(5)均为初次诊断，未进行放化疗治疗。

1.2.2排除标准 (1)合并乳腺癌、宫颈癌等其他恶性肿瘤者；(2)合并肾衰竭、肝炎等重要脏器疾病者；(3)伴凝血功能障碍者；(4)确诊时即存在淋巴结转移患者；(5)随访期间病死、复发患者，或因各种原因未完成随访者。

1.3方法

1.3.1随访 全部患者腹腔镜手术后均在本院接受定期随访，随访方式主要以电话及门诊为主，术后第1～2年，每2～3个月到院复查，第3年，每4～6个月到院复查，内容包括询问患者症状，检测肿瘤标志物等，观察患者淋巴结转移情况。

1.3.2资料中早期OC患者术后淋巴结转移评估及分组方法 查阅患者资料，记录淋巴结转移情况，查阅资料过程中，将发生淋巴结转移者纳入转移组，反之为未转移组；判断方式如下[10]：使用Voluson E8阴道超声检查仪(美国GE)进行检查，探头频率5～9 MHz，指导患者排空膀胱，取膀胱截石位，利用已消毒的避孕套护住探头，缓慢进入阴道3～4 cm，观察卵巢大小、外形及内部回声等情况，观察淋巴结转移情况，一旦发现与圆形结节相似，单个淋巴结最小直径≥1.0 cm可判断淋巴结转移，并结合病理学检查确诊。

1.3.3主要实验室指标搜集方法 收集本次研究所需的实验室相关指标数据，主要包括糖类抗原125(CA125)、人附睾蛋白-4(HE4)等常规肿瘤标志物及主要研究指标外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞水平；检测简要方法如下：于患者入院时，采集清晨空腹外周静脉血6 mL，其中3 mL血液以3 000 r/min速率离心10 min(TD5Z型离心机，厂家：美国贝克曼公司)，离心半径10 cm，取血清，置于冰冻环境下保存待检；分别采用酶联免疫吸附法、化学发光法测定血清HE4、CA125水平；试剂盒由美国R&D公司提供；操作遵照试剂盒说明书进行；剩余3 mL血液采用FACScalibur型流式细胞仪(美国BD公司)检测外周血NK细胞数量及CD8+T淋巴细胞水平。

1.3.4基线资料搜集方法及内容 查阅资料，设计一般资料填写表，采集并记录患者相关资料，主要包括年龄、疾病类型(上皮性癌/恶性生殖细胞肿瘤/其他)、临床分期(Ⅰ期/Ⅱ期)、合并基础疾病[包括高血压(收缩压≥140 mm Hg或舒张压≥90 mm Hg)、糖尿病(空腹血糖≥7 mmol/L，或葡萄糖负荷试验2 h血糖≥11.0 mmol/L)等]等。

2 结 果

2.1两组患者基线资料、主要实验室指标比较 转移组患者入院时血清CA125、HE4水平、外周血CD8+T淋巴细胞水平高于未转移组，外周血NK细胞水平低于未转移组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组患者其他基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2各指标与早期OC患者术后淋巴结转移关系的回归分析结果 将2.1中比较有差异的变量纳入作为自变量(均为连续变量)，将早期OC患者术后淋巴结转移状况作为因变量(1=转移，0=未转移)，经二元Logistic回归分析后，将全部自变量纳入建立多元回归模型，结果显示，入院时HE4、CD8+T淋巴细胞高水平、NK细胞低水平均可能与患者术后淋巴结转移有关，可能作为淋巴结转移发生的风险因子(P<0.05)。见表2。

表2 各指标与早期OC患者术后淋巴结转移关系的回归分析结果

2.3入院时外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞单独及联合预测早期OC患者术后淋巴结转移风险的价值 将早期OC患者术后淋巴结转移状况作为状态变量(1=转移，0=未转移)，将入院时外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞水平作为检验变量，绘制ROC曲线图，见图1。结果显示，入院时NK细胞、CD8+T淋巴细胞单独及联合预测早期OC患者术后淋巴结转移风险的AUC分别为0.894、0.836、0.930，均有一定预测价值，且当二者cut-off值分别取15.142%、25.208%时，可获得最佳预测价值。见表3。

表3 入院时外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞单独及联合预测早期OC患者术后淋巴结转移风险的价值

图1 入院时外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞单独及联合预测早期OC患者术后淋巴结转移风险的ROC曲线图

2.4外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞水平相关性分析 经一般线性双变量Spearman直线相关检验发现，入院时外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞水平之间呈负相关(r=-0.446，P<0.001)。散点图见图2。

图2 外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞水平相关性分析的散点图

3 讨 论

腹腔镜手术具有微创、腹腔暴露少、术后并发症风险低等优势，应用于早期OC患者中，可辅助术者精准切除肿瘤病灶，促进患者术后恢复，提高生存质量[11]。但术后淋巴结转移仍是OC患者预后不良重要因素。因此，寻求可早期预测OC患者术后淋巴结转移的指标成为近年研究重难点。

CA125虽被证实为评估OC患者病情及预后的重要肿瘤标志物，但在乳腺癌、结肠癌或良性妇科疾病中表达也会异常升高，特异度较低[12]。本研究中，转移组患者入院时血清CA125水平高于未转移组，但经回归分析发现，CA125高水平并非早期OC术后淋巴结转移风险因子，这可能与CA125指标稳定性不佳、受其他因素影响有关。HE4是诊断、评估OC的另一常用肿瘤标志物，在正常组织中表达水平较低，在OC患者中血清水平显著升高[13]。据报道，血清HE4与OC淋巴结转移及预后有关，且该指标的灵敏度、特异度较CA125高[14]。本研究结果显示，转移组患者入院时血清HE4水平高于未转移组，且经回归分析发现，HE4高水平与早期OC患者术后淋巴结转移有关，但其风险系数OR值较CD8+T淋巴细胞水平低，出现这一结果可能与该指标易受年龄、基础病等因素影响有关。未来仍需寻求其他可能对预测OC患者术后淋巴结转移风险有一定价值的指标。

近年研究发现，肿瘤发生及发展与机体免疫功能有密切联系，免疫功能紊乱可能会导致肿瘤进一步发展，不利于预后[15]。T淋巴细胞是免疫反应重要参与者，是评价机体免疫功能重要指标，参与机体抗肿瘤免疫应答。CD8+T淋巴细胞属于细胞毒性T淋巴细胞，主要功能是杀伤靶细胞，通过自身或抑制因子对免疫功能起负向调节作用，抑制T淋巴及B淋巴细胞免疫调节，抑制细胞免疫及抗体形成。在机体肿瘤发生及发展过程中，可刺激和诱导CD8+T淋巴细胞增值，而CD8+T淋巴细胞增多在一定程度上促进肿瘤细胞生长，增加转移及复发风险，不利于预后[16]。赵艳勋等[17]研究报道，CD8+T淋巴细胞水平与OC分期呈正相关，可能参与疾病发展。推测外周血CD8+T淋巴细胞水平可能与早期OC腹腔镜术后淋巴结转移有关。NK细胞是机体免疫系统重要组成部分，具有免疫清除及免疫监视功能，可分泌多种细胞因子，如干扰素、肿瘤坏死因子等协同其抗肿瘤[18]。据报道，活化的NK细胞可抑制肿瘤生长及转移，通过扩增NK细胞数量、提高其活性，可增强抗肿瘤效果[19]。推测外周血NK细胞可能与早期OC腹腔镜术后淋巴结转移有关。

本研究结果显示，转移组患者外周血CD8+T淋巴细胞水平高于未转移组，外周血NK细胞水平低于未转移组，且经回归分析发现，入院时CD8+T淋巴细胞高水平、NK细胞低水平均可能与患者术后淋巴结转移有关，说明CD8+T淋巴细胞高水平、NK细胞低水平可能与早期OC患者腹腔镜术后淋巴结转移存在一定联系。分析其原因可能为，CD8+T淋巴细胞水平异常升高，加剧患者失调的免疫调控机制，加重免疫损伤，进一步促进疾病进展；此外，CD8+T淋巴细胞高水平抑制宿主免疫反应，降低消除癌细胞能力，导致肿瘤细胞持续生长，增加淋巴结转移风险[20]。NK细胞低水平可能发挥免疫逃逸作用，促进肿瘤细胞生长、增殖，增加术后淋巴结转移风险[21]。但NK细胞在OC患者中具体作用机制还需证实。进一步绘制ROC曲线发现，入院时NK细胞、CD8+T淋巴细胞单独及联合预测早期OC患者术后淋巴结转移风险均有一定价值，且当二者cut-off值分别取15.142%、25.208%时，可获得最佳预测价值，尤其是二者联合检测预测价值更高，提示未来临床可考虑早期监测早期OC患者外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞水平，一旦发现表达异常，应及时采取相关免疫治疗措施，降低术后淋巴结转移风险；NK细胞、CD8+T淋巴细胞可能作为肿瘤免疫治疗新靶点。此外，本研究还观察外周血NK细胞、CD8+T淋巴细胞之间相关性，发现二者呈负相关，提示NK细胞、CD8+T淋巴细胞可能相互作用，共同参与OC发生及发展，但二者具体作用机制尚未明确，具体结论还需进一步证实。

综上所述，外周血NK细胞低水平、CD8+T淋巴细胞高水平与早期OC患者腹腔镜术后淋巴结转移有关，二者对预测患者术后淋巴结转移风险具有一定价值。