血清miR-671-3p、miR-135b水平与老年乳腺癌患者化疗耐药性的相关性*

余喜梅，张雯捐，龚 烨△

新疆维吾尔自治区人民医院:1.乳腺甲状腺科;2.眼科,新疆乌鲁木齐 830001

现阶段，化疗作为乳腺癌的主要治疗手段之一，可有效杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增殖与生长，延缓病情进展，延长患者生存时间，改善预后[1]。但部分乳腺癌患者接受化疗后存在化疗耐药情况，降低化疗效果，甚至造成化疗失败，增加患者病死风险；特别是老年肿瘤患者，老年患者因机体多系统功能减弱，抵抗能力和耐受能力降低，一旦发生化疗耐药性，病死风险进一步提高[2]。因此，早期预测老年乳腺癌化疗患者是否发生耐药对提高化疗效果，延长患者生存时间具有重要意义。微小核糖核酸(MicroRNA，miR)主要由18～24个核苷酸组成，可通过下调靶基因的表达或翻译参与调节细胞的发育、增殖等过程中[3]。研究指出，miR与多种癌症疾病的发生、发展密切相关，也与癌症疾病化疗耐药性的产生存在密切关联[4]。miR-671-3p是miR-671家族的成员之一，已有研究证实，miR-671-3p过表达可明显抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭迁移能力[5]。miR-135b也是miR的常见类型之一，研究指出，miR-135b在三阴性乳腺癌、胃癌等多种癌性疾病中呈高表达现象，可发挥促癌基因的作用[6]。由上述miR-671-3p、miR-135b在肿瘤疾病中的作用特点，推测血清miR-671-3p、miR-135b水平可能与老年乳腺癌患者化疗耐药性有关。基于此，本研究将重点分析血清miR-671-3p、miR-135b水平与老年乳腺癌患者化疗耐药性的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2019年1月至2020年2月在本院接受化疗且化疗结束后产生耐药性的52例老年乳腺癌患者作为耐药组，另同期选取在本院接受化疗且化疗结束后未产生耐药性的52例老年乳腺癌患者作为敏感组，收集两组病历资料。纳入标准：(1)乳腺癌符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2017年版)》[7]中相关诊断标准，且经乳腺超声、乳腺钼靶、穿刺活检等检查确诊；(2)预计生存时间>6个月；(3)恶性肿瘤国际临床病期分期(TNM)[8]为ⅡB期、Ⅲ期；(4)全部患者均接受同一种新辅助化疗方案，且化疗周期一致；(5)患者病历资料、影像学检查结果等资料均完整。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)既往接受手术治疗；(3)既往接受放化疗；(4)原位癌成分太多难以确认浸润性癌大小或无法临床评估疗效；(5)化疗前白细胞<3×109/L；(6)化疗前血小板<80×109/L；(7)伴有远处转移。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

1.2方法

1.2.1新辅助化疗方法 参照《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2017年版)》中相关内容，为老年乳腺癌患者实施新辅助化疗，具体内容如下：采用FAC新辅助化疗方案，环磷酰胺+多柔比星+氟尿嘧啶。环磷酰胺(通化茂祥，生产批号20181120，规格：50 mg×24 s)：第1天，静脉冲入，500 mg/m2；多柔比星(海正辉瑞制药有限公司，生产批号20180623，规格为50 mg)：第1天，静脉冲入，50 mg/m2；氟尿嘧啶(通化茂祥，国药准字H22023469，规格为10 mL：0.25 g)：第1、8天，静脉滴注，600 mg/m2。21 d为1个周期，共化疗6个周期。

1.2.2化疗耐药性检测方法 化疗结束1 d时，在超声引导下，患者接受穿刺活检，取0.5～1.0 mm的新鲜肿瘤组织，使用组织消化酶进行消化，消化后使用筛网过滤，最后使用湖南迈克尔实验仪器有限公司的KC-42B低速离心机进行离心处理，以3 000 r/min的离心速度离心10 min，离心完毕后取细胞悬液，并将其加入在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培养基中，制备细胞混悬液。在冰浴环境下，制备细胞-胶原蛋白混合液，接种在24孔的细胞培养板内。24 h后，加入血浆药物浓度的环磷酰胺，静置24 h。试验过程中涉及无药药物的空白组。结果判定标准：采用含药组的细胞数量/空白组数目的百分比评估药物敏感性，若<50%则判定为化疗敏感，≥50%则为化疗耐药，分别纳入耐药组和敏感组。

1.2.3基线资料调查方法 自制基线资料调查问卷，详细询问患者及其家属并记录患者一般情况，内容包括：(1)年龄；(2)肿瘤最大径；(3)TNM分期：划分为ⅡB期、Ⅲ期；(4)饮酒史：饮酒时间>5年，每次摄入酒精量>10 g；(5)吸烟史：连续或累计吸烟6个月或以上；(6)体重指数(BMI)：体重正常(BMI<23.9 kg/m2)、肥胖或超重(BMI≥23.9 kg/m2)；(7)合并高血压：参照指南进行判定[9]；(8)合并糖尿病：参照指南进行判定[10]。

1.2.4实验室指标检测方法 全部患者均于化疗前，采集清晨空腹静脉血10 mL，共分为5支试管。(1)白细胞计数、中性粒细胞：使用长沙英泰仪器有限公司的TD4A型低速医用离心机，以1 500 r/min的离心速度共离心5 min，离心半径10 cm，离心完毕后取上清液待检。使用日本Sysmxe公司的XE-2100全自动血液分析仪检测白细胞计数、中性粒细胞。(2)C-反应蛋白(CRP)、血红蛋白：经离心机分别进行离心处理，离心速度均为3 000 r/min，离心时间均为10 min，离心半径均为15 cm，离心完毕后均取上清液待检。使用武汉明德生物科技股份有限公司的试剂盒，采用化学发光免疫分析法测定CRP水平。使用日本希森美康XS-800i血细胞分析仪测定血红蛋白水平。(3)血清糖类抗原(CA)125、CA199：经离心机进行离心处理，以8 000 r/min的离心速度共离心6 min，离心半径16 cm，离心完毕后取上清液待检。使用上海酶联生物科技有限公司的试剂盒，采用酶联免疫吸附试验法测定血清CA125、CA199水平。(4)血清miR-671-3p、miR-135b：经离心机进行离心处理，以3 000 r/min的离心速度，共离心10 min，离心半径15 cm，离心完毕后取上清液待检。以总RNA 5 μL为模板，使用美国应用生物系统公司的试剂盒进行逆转录合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。总反应体系为15 μL，反应条件如下：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。miR-671-3p的正向引物序列：5′-TCCGGTTCTCAGGGC-3′；反向引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。内参基因U6上游序列：5′-GCTTCGGCACCATATACTAAAAT-3′；下游序列：5′-CGC TTCACGAATTTGAGTGTCAT-3′。miR-135b的正向引物序列：5′-GTCTCGAGCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；反向引物序列：5′-TAAAGCTTCTGGATACGACCACATA-3′。内参基因U6上游序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；下游序列：5′-CGCTTCACGAATTTGAGTGTCAT-3′。以cRNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增。扩增条件： 95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，40个循环。以U6为内参照，采用2-ΔΔCt法计算miR-671-3p mRNA相对表达量和miR-135b mRNA相对表达量。

2 结 果

2.1各组患者基线资料对比 耐药组和敏感组的基线资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者基线资料对比

续表1 两组患者基线资料对比

2.2两组患者实验室指标对比 耐药组的血清miR-671-3p mRNA相对表达量低于敏感组，miR-135b mRNA相对表达量高于敏感组，差异有统计学意义(P<0.05)，组间其他实验室指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组患者实验室指标对比[M(P25，P75)]

2.3老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相对表达量与miR-135b mRNA相对表达量的相关性 Spearman相关分析显示，老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相对表达量与miR-135b mRNA相对表达量呈负相关(r=-0.359，P<0.001)。相关性散点图见图1。

图1 老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相对表达量与miR-135b mRNA相对表达量的相关性散点图

2.4血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量与老年乳腺癌患者化疗耐药性关系的回归分析 将基线资料与实验室指标分析结果得到有意义的变量(均为连续变量)作为自变量，将老年乳腺癌患者化疗耐药性情况作为因变量(1=耐药，0=敏感)，经二元回归分析后，将P值放宽至<0.2，将符合条件的因素同时纳入作为自变量，经多元Logistic回归分析结果显示，老年乳腺癌患者化疗前1 d时的血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量与患者化疗耐药性有关，血清miR-671-3p mRNA相对表达量高表达是老年乳腺癌患者化疗耐药性的保护因素(OR<1，P<0.05)；miR-135b mRNA相对表达量高表达是老年乳腺癌患者化疗耐药性的危险因素(OR>1，P<0.05)。见表3。

表3 血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量与老年乳腺癌患者化疗耐药性关系的回归分析

2.5血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量预测老年乳腺癌患者化疗耐药性风险的效能分析 将患者化疗前血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量作为检验变量，老年乳腺癌患者化疗耐药情况作为状态变量(1=耐药，0=敏感)，绘制ROC曲线(见图2)，结果显示，老年乳腺癌患者化疗前血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量预测化疗耐药性风险的AUC均>0.70，预测价值较理想，且以患者化疗前血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量cut-off值取1.035、2.420时，联合预测的价值最好。相关参数见表4。

表4 血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量预测老年乳腺癌患者化疗耐药性风险的效能分析结果

图2 血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135bmRNA相对表达量预测老年乳腺癌患者化疗耐药性风险的ROC曲线图

3 讨 论

化疗已被证实是乳腺癌的重要治疗方法，但部分患者化疗后存在耐药性，化疗效果欠佳，肿瘤组织未见缩小，甚至仍有所增长，病情有所加重，且老年患者机体衰退，一旦发生化疗耐药性，预后风险进一步升高[11]。因此，为预防老年乳腺癌患者产生化疗耐药性，需早期预测患者化疗耐药性发生风险，并给出针对性建议。

研究指出，细胞凋亡与化疗耐药性密切相关，凋亡因子的异常表达可降低化疗药物对肿瘤细胞的促凋亡作用，从而提高化疗耐药风险[12]。miRNA已被研究证实可调节肿瘤细胞信号转导通路，参与肿瘤细胞凋亡、浸润转移等过程[13]。作为miRNA的一种，miR-671-3p能诱导肿瘤细胞发生侵袭迁移、增殖等细胞学行为[14]。miR-135b基因位于第一号染色体，在多种癌症疾病发生、发展中发挥重要作用，研究指出，miR-135b可通过激活Hippo通路，增强癌细胞的侵袭和转移能力[15]。同时，miR-135b表达上调可刺激雌激素受体α、雄激素受体和缺氧诱导因子1α，从而促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、生长[16]。结合上述血清miR-671-3p、miR-135b与肿瘤细胞的增殖、生长的关系，推测二者可能参与了老年乳腺癌化疗耐药的发生及发展。本研究经对比化疗耐药与敏感的老年乳腺癌患者的血清miR-671-3pmRNA相对表达量、miR-135bmRNA相对表达量，结果显示，耐药组的血清miR-671-3p mRNA相对表达量低于敏感组，miR-135b mRNA相对表达量高于敏感组，初步推测血清miR-671-3p、miR-135b可能与老年乳腺癌患者的化疗耐药性有关。进一步作回归分析结果显示，血清miR-671-3p、miR-135b与老年乳腺癌患者的化疗耐药性有关，血清miR-671-3p mRNA相对表达量低、miR-135b mRNA相对表达量高可能是老年乳腺癌患者化疗耐药性的风险因子，证实上述猜测。分析可能的原因如下：血清miR-671-3p的直接靶基因为DEPTOR蛋白，当其过表达时，可抑制DEPTOR蛋白发挥作用，从而影响下游基因的表达，继而抑制乳腺癌细胞的侵袭、迁移等能力，降低化疗耐药性发生风险[17]。miR-135b可靶向抑制肿瘤抑制基因(APC基因)，促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移，提高化疗耐药性发生风险[18]。最后，本研究绘制ROC曲线分析血清miR-671-3p、miR-135b预测老年乳腺癌患者化疗耐药性的价值，结果显示，患者化疗前1 d时的血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量预测老年乳腺癌患者化疗耐药性风险的AUC均>0.70，预测价值较理想，且以患者化疗前血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量cut-off值取1.035、2.420时，联合预测的价值最好。表明血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量不仅可能是老年乳腺癌患者化疗耐药性的风险因子，也可作为老年乳腺癌患者化疗耐药性的预测标志物。上述结果也表明，早期可动态检测老年乳腺癌患者的血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量，若发现二者异常变化，建议可以提前为患者实施中西医结合治疗、免疫治疗等干预，以改善血清miR-671-3p mRNA相对表达量、miR-135b mRNA相对表达量，可能对降低老年乳腺癌患者化疗耐药性风险有一定价值。此外，本研究还对患者血清miR-671-3p与血清miR-135b进行相关性分析，结果显示，老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相对表达量与miR-135b mRNA相对表达量呈负相关，提示老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相对表达量与血清miR-135b mRNA相对表达量之间可能存在一定联系，二者可能相互影响、相互作用，共同参与了老年乳腺癌患者化疗耐药性的发生，但尚不能根据此次研究结果推断上述指标之间在疾病中相互影响，加之目前关于二者的关系研究甚少，具体关系及机制还需要在未来进一步开展更多的研究加以明确。

综上所述，老年乳腺癌患者化疗耐药性可能与血清miR-671-3p、miR-135b表达异常有关，临床可考虑通过早期监测老年乳腺癌患者的血清miR-671-3p、miR-135b表达，预测化疗耐药性风险并指导干预，可能对降低化疗耐药性、促进良性预后有积极意义。