含季铵盐交联结构的光敏感胶束的合成*

2022-07-29赵鹏娟李泽鹏冯文智郝士军余丽丽

化工科技 2022年2期

赵鹏娟，归萌，徐宇，李泽鹏，冯文智，郝士军，余丽丽**

(1.西安医学院药学院，陕西西安 710021；2.西安医学院药物研究所，陕西西安 710021)

刺激敏感型聚合物指能够对环境变化作出响应的一类功能性高分子材料，常见的刺激因素有pH值[1]、温度[2]、光照[3]、氧化还原电位[4-5]、葡萄糖[6]等。该类材料由于其良好的结构可控性，常被设计用于功能性药物载体材料，尤其是药物控释材料。光是一种清洁、无创、有效、可控的刺激源，光敏感型药物载体材料可通过调节光强、光照时间和刺激部位，实现药物在病灶部位有效控释，从而达到药物靶向释放的目的[3]。光敏感型药物载体材料可通过在结构中引入光敏感型基团来实现，常见的敏感型基团主要有光致断裂型(如邻硝基苄基氧和香豆素基团等)、光致异构型(如螺吡喃)、光致重排型(如2-重氮-1,2-萘醌基团)、光致交联型(如香豆素、肉桂酸)[3,7-8]。

糖是人体重要的生物信息分子，在细胞分化、黏附和增殖等许多重要的生理过程发挥着关键作用。在靶向型药物输送体系研究中，含糖载体受到了广泛的关注[9]。Song等[10]合成了一系列含糖药物载体(包括含半乳糖)，并通过荧光标记的方式验证了其对肺泡巨噬细胞的识别。Pearson等[11]则研究了含半乳糖载体对人黑色素瘤细胞的靶向识别作用。

作者以含邻硝基苄基氧的交联剂为光敏感型交联剂，设计合成了一种梳形含半乳糖的两亲聚合物[LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]，并研究了其结构和光敏感性能。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：分析纯，天津市津北精细化工有限公司；碳酸钾：分析纯，天津市河东区红岩试剂厂；甲基丙烯酸聚乙二醇酯500(PEGMA 500)、甲基丙烯酸聚乙二醇酯300(PEGMA 300)：化学纯，山东德彦化工有限公司；硼氢化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；邻硝基苯乙酮：纯度98%，溴化亚铜：纯度99.5%，溴化铜：纯度99.5%，乳糖酸(LA)：纯度97%，甲基丙烯酸二甲氨乙酯(DAEMA)：纯度99.5%，叔丁氧羰基乙醇胺(Boc-乙醇胺)：纯度98%，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)：纯度99.5%，萨恩化学技术(上海)有限公司；3-溴丙酰氯：纯度>95%，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；碘化钾：纯度99%，上海竺钥化工有限公司；尼罗红(NR)：纯度97.5%，甲基丙烯酸甲酯(MMA)：纯度99.8%，N,N,N,N,N-五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)：纯度98%，北京百灵威科技有限公司。

傅里叶变换红外光谱仪：TENSOR-27，德国布鲁克公司；荧光分光光度计：LS55，Perkin Elmer公司；马尔文激光粒度仪：ZEN3600，英国马尔文仪器有限公司。

1.2 光敏感交联剂和自由基聚合引发剂的合成

光敏感交联剂和自由基引发剂的合成路线见图1。

a 光敏感交联剂

b 自由基引发剂图1 光敏感交联剂和自由基引发剂的合成路线

由图1a可知，以邻硝基苯乙酮为初始原料，通过α-溴代、还原环合、开环、酯化获得了二溴代的光敏感交联剂[12]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：8.02(dd,J=8.2,1.2 Hz,1H),7.91(dd,J=7.9,1.3 Hz,1H),7.76～7.64(m,1H),7.56～7.45(m,1H),5.63(dd,J=7.2,3.3 Hz,1H),4.41(dd,J=11.4,7.3 Hz,1H),4.19(t,J=6.3 Hz,1H),3.59(dd,J=6.6,3.8,2.6 Hz,4H),3.14～2.80(m,4H)。

由图1b可知，以Boc-乙醇胺为原料通过酯化和脱保护合成了含氨基的自由基引发剂，具体操作如下。取Boc-乙醇胺(2.61 g，0.016 2 mmol)在冰浴中加入2,6-二甲基吡啶(2.77 g，0.025 9 mmol)和20 mL无水二氯甲烷，将2-溴-2-甲基丙酰溴(5.38 g，0.023 4 mmol)溶于9 mL无水二氯甲烷中，用滴液漏斗缓慢滴至体系中。室温搅拌反应4 h，用饱和NaHCO3洗涤(3次)，无水硫酸钠干燥、减压浓缩后用乙酸乙酯-正己烷在-70 ℃下结晶得引发剂1(4.106 g)，产率100%。取引发剂1(0.8 g，0.6 mmol)加入4 mL三氟乙酸(TFA)，常温搅拌4 h后减压浓缩至油状物，加少量二氯甲烷，-30 ℃下用乙醚重结晶，得白色晶体，得引发剂2(0.602 g)，产率75.3%。

1.3 半乳糖修饰的两亲聚合物[LA-PEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]的合成

两亲聚合物[LA-PEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]的合成见图2，具体实验过程通过以下4步完成。

图2 含光敏感交联剂的两亲聚合物[LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]的合成路线

1.3.1 氨基封端的亲水端(NH2-PPEGMA-Br)的合成

取0.260 g的引发剂2于聚合反应管(见图2)中，加入6 mL的1,4-二氧六环使其溶解，加入0.591 g PEGMA 500、3.949 1 g PEGMA 300、58.4 mg溴化亚铜和0.140 g PMDETA后，封闭反应管，进行冷冻-抽真空-充氮气-解冻，循环4次，于90 ℃下反应6 h，通空气停止反应。以二氯甲烷为流动相过中性氧化铝柱，减压浓缩得绿色黏稠状固体。溶于0.5 mL的二氯甲烷后在5 mL正己烷中沉降3次，得到0.23 g NH2-PPEGMA-Br。

1.3.2 氨基封端的两亲聚合物[NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)]的合成

取254 mg NH2-PPEGMA-Br于聚合反应管中，加入3 mL 1,4-二氧六环使其溶解，加入0.528 5 g(5.279 mmol)的MMA、0.476 7 g(3.032 mmol)的DAEMA、42 μL的PMDETA以及29.5 mg(0.206 mmol)的溴化亚铜，封闭反应管，进行冷冻-抽真空-充氮气-解冻，循环4次，于90 ℃下反应过夜。以四氢呋喃为流动相过中性氧化铝柱，浓缩后，溶于0.5 mL二氯甲烷后在5 mL正己烷中沉降3次，得到0.2 g NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)。

1.3.3 半乳糖修饰的两亲聚合物[LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)]的合成

称取200 mg(0.558 mmol)乳糖酸，90 mg(0.237 mmol)HATU于聚合反应管中，加入20 mL 二甲基亚砜，再加入92 μL的三乙胺，此时溶液呈现黄色。称取223.5 mg NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)，加入5 mL二甲基亚砜溶解后，加入至上述体系中，搅拌过夜，此时溶液呈黄绿色。用截留分子量为500 Da的透析袋在双蒸水中透析24 h至溶液呈乳白色，浓缩即得100 mg LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)。

1.3.4 含光敏感交联剂的两亲聚合物[LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]的合成

取0.1 g的LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)溶于丙酮后加入4 mg的碘化钾和10 mg交联剂，于80 ℃加热回流20 h，冷却至室温，减压浓缩，加入0.5 mL的四氢呋喃在5 mL石油醚中沉降3次，得80 mg产物。

1.4 结构表征

取微量样品[NH2-PPEGMA-Br、NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)、LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)、LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]粉末，与光谱纯溴化钾充分研磨后压片，通过傅里叶变换红外光谱仪测定其红外光谱。将样品溶于氘代氯仿后测定1H NMR。

1.5 载NR胶束的构建、临界胶束浓度(CMC)值的测定和光敏感性

以DMF为溶剂配置ρ(聚合物)=10 mg/mL母液和ρ(NR)=1 mg/mL母液，取一定量的聚合物母液加入500 μL NR母液，以5～6滴/min的速度缓慢滴加1 mL蒸馏水后，常温搅拌6 h，再加入9 mL的蒸馏水，透析(截留分子量8 000～14 000 Da)2 d，定容至15 mL，即得载NR的胶束。将ρ(聚合物)分别稀释至0.001～0.3 mg/mL，在543 nm的激发波长处，采用荧光分光光度计测定其荧光强度，绘图获得CMC值。

1.6 光敏感性研究

测定载NR胶束在不同pH值(pH=2.2～10.0)下和不同光照时间(t=0～20 min)的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

采用FTIR和1H NMR表征了聚合物的结构,聚合物的红外光谱图见图3。

σ/cm-1—NH2-PPEGMA-Br；—NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)；—LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)；—LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL图3 聚合物的红外谱图

由图3可知，1 728 cm-1为聚合后形成的饱和脂肪酸酯羰基的伸缩振动吸收峰，1 155 cm-1归属于PEG结构的饱和脂肪醚C—O—C伸缩振动吸收峰，1 106 cm-1则归属于叔胺的C—N伸缩振动吸收峰。LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL红外图谱中出现的1 530 cm-1的吸收峰归属于交联剂的芳香族的—NO2反对称伸缩吸收峰，证明了交联剂的顺利接入。

聚合物的1H NMR图谱见图4。

由图4a可知，δ=4.11归属于PEG酯端联接亚甲基的氢(—OCOCH2—)、MMA酯结构中的甲基氢(—OCOCH3)、以及DAEMA酯结构中的亚甲基氢(—OCOCH2—)、δ=1.66～1.90为DAEMA和聚合物骨架中亚甲基的氢，δ=0.87～0.91为骨架中的—CH3氢信号。约δ=3.85的信号则归属于半乳糖氢。由图4b可知，δ=7.52～8.04的氢信号归属于交联剂的苯环氢。

δa 聚合物骨架的氢信号

δb 聚合物中交联剂的芳香环氢信号图4 聚合物的1H NMR谱

2.2 胶束的形成

两亲分子在水中形成胶束所需的最低浓度称为临界胶束浓度(CMC)。NR是一种脂溶性荧光染料，在极性环境中NR几乎不溶，荧光强度很弱，而在非极性环境中，NR的溶解度较高，其荧光强度会显著增强，因此，可作为荧光探针用于CMC值的测定，见图5。

λ/nma 不同浓度聚合物包载NR的荧光光谱

logcb 630.6 nm下荧光发射强度和logc之间的关系图5 两亲聚合物的CMC值测定

由图5a可知，聚合物在低浓度条件下，体系的荧光弱，随着聚合物浓度的增加，体系的荧光强度不断增强，这是由于在低聚合物浓度条件下，体系中无胶束，水体系中荧光强度较弱，随着聚合物浓度提高，满足表面吸附后的聚合物进入水体系中自组装形成胶束，NR溶于胶束的脂溶性中心，表现出较强的荧光强度。由图5b可知，随着聚合物浓度的提高，I值从7.4增加到460，表明在该浓度范围内聚合物发生了胶束化的变化，通过求拐点得到聚合物的CMC值为0.062 9 mg/mL。采用动态光散射检测了胶束的粒径和电位，测得该胶束的粒径为359.2 nm(PDI为0.394)，Zeta电位为27.9 mV，可见该胶束带正电，且胶束的电位大于25 mV，应该具有较强的分散性和稳定性。

2.3 不同的pH值下光敏感性的研究

实验研究了载NR胶束在光照条件下荧光强度的变化，荧光强度降低代表着胶束中载负的荧光分子被释放，结果见图6、图7。

λ/nma pH=2.2

λ/nmb pH=5.0

λ/nmc pH=6.5

λ/nmd pH=7.4

λ/nme pH=10.0图6 胶束光敏感性研究

由图6可知，在强酸性条件下(pH=2.2)随着光照的进行，体系荧光强度增强，可能是由于酸性条件下聚合物结构中的叔胺结构发生质子化形成季铵盐结构，链段间的排斥力增强，使得胶束发生溶胀，而随着光照时间的进行，体系的温度上升，促进了溶胀和质子化的发生使得胶束的包载空间和能力均增强，因此出现荧光强度增强的现象。在相对较弱的酸性条件下(pH=5.0)也出现相类似的趋势，但是荧光强度增大趋势下降。

pH图7 光照时间对荧光强度的影响

由图7可知，pH=6.5、7.4，随着光照的延长，胶束的荧光强度基本呈下降趋势，这是由于在接近中性的环境中，叔胺结构发生质子化的比率下降，随着光照时间的增加，光敏感性交联剂发生断裂造成了胶束结构疏松从而使得包载进去的NR更易释放出来。而在碱性条件下(pH=10.0)，随着光照时间的延长，该胶束的荧光强度呈上升趋势。可能是因为在碱性条件下去质子化，使胶束结构更为紧密，抵抗了光敏感基团的断裂对药物释放的促进作用，同时光照的热量反而增加了NR的溶解性能，所以引起荧光强度的线性上升。