草菇对牛肉蛋白结构的修饰效应

沈双伟，青正龙，林伟玲，张贤斌，刘学铭，林耀盛，唐道邦，王旭苹，程镜蓉*，朱明军

（1.喀什大学生命与地理科学学院，新疆喀什 844000）

（2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）

（3.叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室，新疆喀什 844000）

（4.中山市黄圃镇农业服务中心，广东中山528429）

（5.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）

肉糜是肉制品加工中最为常见的原料之一，主要由蛋白质、脂肪颗粒、碳水化合物、水和盐组成[1]。肉糜加工方便，是生产香肠、肉饼、肉脯、肉丸等肉制品的重要原料。肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）作为肌肉中含量最高的蛋白质，约占肉蛋白总含量的55%～60%，是肉制品加工过程中较为重要的一类结构蛋白。其结构和功能特性会直接影响到肉制品的感官性质。此外，MP 具有优良的凝胶特性，在维持肉制品较好的质构特性和感官品质中发挥重要作用[2]。然而，肉制品在加工贮藏的过程中会不可避免的发生蛋白质氧化。其中，MP的氧化程度直接影响着肉制品的质构、风味及加工特性[3]。研究表明，MP 的过度氧化会造成肉及肉制品品质的下降，如：保水性降低、蒸煮损失增大、凝胶性能下降、蛋白质的消化率降低等[4-6]；然而，适度氧化却有助于促进蛋白质相互交联，提高风味物质吸附或释放能力，改善产品的质构和风味。Shen等[7]提出适度的氧化可以诱导MP 部分解折叠，进一步提高MP 的盐溶性和凝胶硬度，促进MP 凝胶与某些醛和酮类等风味物质的结合。伏慧慧等[8]发现某些肉制品中的蛋白适度氧化对其质构、滋味、风味及色泽会产生积极的促进作用。

食用菌，因其味道鲜美且富含纤维，对肉制品风味及质构等品质的影响备受关注。草菇作为一种重要的热带亚热带菇类，是世界上第三大栽培食用菌。其营养丰富，味道鲜美，作为风味补充剂近年来在肉制品（如草菇腊肠、草菇肉酱等）中被广泛应用。近期有研究表明[9]，食用菌对肉制品风味的影响并不是二者风味的简单叠加，其与肉制品组分（如蛋白质、脂质）的相互作用很有可能是促成风味物质合成的重要途径。当前，人们主要关注食用菌对肉制品风味的影响，但对相关机理的探究较少。本课题组在前期探索中发现[10]，草菇对肉糜组分的相互作用可能是影响肉糜质构和风味的重要因素。鉴于此，本研究以牛肉糜蛋白为对象，进一步探索草菇对牛肉糜蛋白质的结构及功能的影响，以期为食用菌改善肉糜品质的机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

草菇为光柄菇科真菌草菇（Volvariella volvacea(Bull.:Fr.) Sing.）的子实体，牛肉（水牛，Bubalus bubalis）为牛外脊肌肉，草菇和牛肉均购自广州市澳之星超市；超纯水，美国Milli-Q 纯水仪；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X），上海碧云天生物公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PB-10 数字pH 计，德国Sartorius 集团；UltraScan VIS 色度仪，美国Hunter Lab 公司；SKD-100 自动凯氏定氮仪，上海沛欧分析仪器有限公司；Jasco J-1500-150CD 光谱仪，日本东京 Jasco 公司；AR1500EX TA 流变仪，美国NewCastle 公司；T25D均质机，德国IKA 集团。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

1.3.1.1 草菇粉末的制备

草菇使用蒸馏水冲洗两次，去除菌体上肉眼可见的异物，使用热风干燥箱45 ℃干燥至恒重。干燥的食用菌使用BJ-300 高速破碎器磨成粉末，为防止破碎器过热对食用菌造成影响，每破碎10 s 后暂停机器，待机器温度降至室温后再次破碎。破碎后的草菇过20目的聚乙烯筛，随后使用密封袋密封，保存于4 ℃备用。

1.3.1.2 草菇牛肉糜的制备

牛外脊肉使用配备有6 mm 直径孔板的绞肉机绞碎成肉糜。样品分为2 个组：不添加食用菌干粉的肉糜（Control）；添加5%（m/m）草菇干粉的肉糜（5%Vv）。样品组分如下：牛肉糜1000 g，牛板油100 g，水50 g，盐20 g，复合磷酸盐4 g，食用菌干粉50 g。将牛肉糜和其它配料放入搅拌机中搅拌（30 min）后，于4 ℃静置腌制，在0、12、24、36 和48 h 五个时间点分别取样进行实验。

1.3.2 草菇对牛肉糜理化性质的影响

pH 值：参照国标GB 5009.237-2016[11]对肉糜的pH 值进行测定。取1 g 样品与9 mL 0.1 mol/L 的KCl溶液混合，10000 r/min 均质1 min 后使用pH 计进行测定，每个样品测试三次，结果表示为平均值±标准差。

蒸煮损失：使用模具将样品（m1）制成厚1 cm，直径为5 cm 的肉饼，75 ℃水浴25 min，用流水将样品冷却至室温后在4 ℃放置过夜。去除模具，使用吸水纸去除样品表面水分，然后记录样品质量（m2）。每个样品测试三次，结果表示为平均值±标准差。计算公式如下：

色度：使用模具将样品制成厚度为1 cm，直径为5 cm 肉饼，80 ℃水浴20 min 后，自然冷却至室温。使用Ultrascan-VIS 色度计对样品色度进行定量，以确定样品的亮度（L*）、红色（a*）和黄色（b*）值，标准白板读数为（L*=99.44，a*=-0.09，b*=0.35）。从每个实验组中抽取三个样品进行评估。结果表示为平均值±标准差。

挥发性盐基氮（Volatile basic nitrogen，TVB-N）：按照国标GB 5009.228-2016[12]中自动凯氏定氮仪法测定。每个样品测试三次，结果表示为平均值±标准差。

1.3.3 肉糜总蛋白水溶性测定

根据Vissessanguan 等[13]的方法略作修改，测定样品总蛋白水溶性。溶剂有：S1：0.6 mol/L KCl；S2：20 mmol/L Tris，pH=8；S3：20 mmol/L Tris，pH=8，含有1%（m/V）SDS；S4：20 mmol/L Tris，pH=8，含有1%（m/V）SDS 和8 mol/L 尿素；S5：20 mmol/L Tris，pH=8，含有1%（m/V）SDS，8 mol/L 尿素和2%（V/V）β-巯基乙醇；S6：0.5 mol/L NaOH。取2 g样品与18 mL 上述溶液混合，室温下10000 r/min 均质1 min 后4 ℃静置2 h。均质后的样品匀浆在10000 r/min 下离心15 min，上清液使用中速滤纸过滤，保留滤液。取4 mL 滤液，加入1 mL 预冷的50% TCA，4 ℃静置2 h 后4000 r/min 离心15 min，保留沉淀。沉淀使用S6 溶解结果，以各部分蛋白含量占S6 的百分比表示。

如无特别说明，本实验中的蛋白含量均采用双缩脲法[14]测定。

1.3.4 肌原纤维蛋白的提取

牛肉肌原纤维蛋白（MP）的提取依据Park 等[15]的方法略作修改。牛外脊肉剔除可见的脂肪和结缔组织后，使用搅碎机将其破碎成肉糜。称取25 g 肉糜加入100 mL 的僵直液（0.1 mol/L NaCl，23.1 mmol/L Na3PO4，4.3 mmol/L MgCl2，1.1 mmol/L EDTA-2Na；pH=7），10000 r/min 均质1 min 后4000 r/min 离心5 min，保留沉淀。再次加入100 mL 僵直液，重复上述步骤三次，最后保留沉淀。沉淀中加入100 mL 0.1 mol/L 的NaCl 溶液，使用上述条件均质并离心，重复操作3～5 次，每次保留上清液。所得上清液经两层纱布过滤，收集所有滤液，调整滤液pH 至6.25 左右，静置10 min（以出现絮状沉淀为准），4000 r/min 离心5 min，收集膏状残留物，所得膏状沉淀视为纯化后的MP，加入0.6 mol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH=7）溶液5～10 mL 溶解沉淀。所得MP 置于100 mL 离心杯中均质，混匀后保存于碎冰中备用，并于48 h 内使用。

1.3.5 MP 羰基含量的测定

羰基含量的测定基于2,4-二硝基苯肼（DNPH）法[16]并略作修改。2 g 样品加入18 mL 生理盐水后10000 r/min 均质两次（30 s/次）。取2 份样品均质溶液（0.1 mL），一份加入0.5 mL 2 mol/L 的HCl（组A），另一份加入0.5 mL 2 mol/L 的HCl（含有0.02 mol/L的DNPH）（组B），然后37 ℃水浴15 min，加入0.5 mL 20%的三氯乙酸溶液，旋涡振荡混匀，然后10000 r/min离心5 min，弃掉上清，沉淀使用1 mL 乙醇和乙酸乙酯混合物（V/V=1:1）清洗3 次后再次10000 r/min 离心5 min，最后所得沉淀用1 mL 6 mol/L 的盐酸胍溶液溶解（37 ℃，水浴15 min），使用去离子水稀释5倍，在370 nm 测OD 值。计算公式如下：

式中：

A370=A组A-A组B；

Cpro——蛋白浓度；

摩尔消光系数——21000 L/(mol·cm)。

1.3.6 MP 巯基含量测定

样品巯基含量的测定依照Ellman 的方法[17]并略作修改。0.5 mL 样品均质液加入2.5 mL Tris-Gly-尿素（pH=8.0），充分振荡混匀，实验组加入20 μL Ellman试剂，对照组中加20 μL Tris-Gly 溶液，37 ℃水浴15 min，10000 r/min 离心5 min，使用分光光度计测定上清液在412 nm 处吸光值。摩尔消光系数13.6×103L/(mol·cm)，计算公式如下：

式中：

73.53=106/13.6×103；

A412=A实验组-A对照组；

Cpro——蛋白浓度。

1.3.7 MP 二级结构测定

采用圆二色谱评价食用菌对牛肉糜MP 二级结构的影响。用蒸馏水将MP 稀释至0.1 mg/mL，取200 μL稀释后的蛋白溶液加入石英比色皿（1 mm）中。使用J-1500-150 CD 色谱仪在24 ℃（±1 ℃）下扫描。扫描波长：190～260 nm，扫描速度为5 nm/min。每个样品扫描三次，结果为三次扫描的平均值并扣除相应溶剂背景。在获得CD 谱后，利用二级结构分析软件CNDD（CD 谱反褶积 2.1；http://bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn/）对实验数据进行分析，所用的参考蛋白为标准蛋白SP175（平均氨基残基为110 g/mol）[18]，波长计算范围为200～250 nm。每个样品测定三次重复，计算结果表示为平均值±标准差。

1.3.8 十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析

食用菌对牛肉糜MP 的影响采用SDS-PAGE 进行分析[19]。浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%。将MP 稀释为浓度5 mg/mL 的蛋白溶液，取0.4 mL 上述浓度蛋白溶液加入0.1 mL 上样缓冲液，漩涡混匀后，沸水浴5 min，取出于冰水浴中降温至室温后进行上样，上样量为10 μL。采用恒压模式，第一阶段电压为40 V，第二阶段电压为80 V，待蓝色指示带位移动至凝胶底部，停止电泳。凝胶使用考马斯亮蓝G250染色，随后用脱色液褪色并拍照。

1.3.9 MP 流变特征

根据Wu 等[20]描述的方法略加修改，对添加草菇后牛肉糜的MP 流变特性进行测试。将MP 稀释为15 mg/mL，取2 mL 稀释后的MP 溶液装载于流变仪平台上进行测试。模式：振荡加热模式；加热速率：2 ℃/min；温度范围：25 ℃～75 ℃。利用储能模量（G'）和Tanδ（G''（损耗模量）/G'）表征MP 溶液在凝胶转变过程中的粘弹性变化。

1.4 数据分析

实验均设置3 组平行，数据结果为平均值±标准差。使用SPSS 19.0 统计软件程序做出分析。使用Anova 和Duncan 的多重范围检验来进行显着性差异分析，其中p＜0.05 才认定有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 草菇对牛肉糜理化性质的影响

腌制前后样品的TVB-N 值、蒸煮损失、pH 值和色度详见表1。TVB-N 通常指在食品生产和贮藏过程中，由于酶或微生物的作用，蛋白质分解产生的碱性含氮物质[21]。其中添加草菇后肉糜的TVB-N 值为13.15～16.74 mg/100 g（0～48 h），明显高于对照组的4.24～7.55 mg/100 g 样品（0～48 h）。在内源性酶或微生物的作用下，肉制品的TVB-N 值随着时间的延长而增加。草菇处理后，牛肉糜的TVB-N 值迅速增加，甚至超过了草菇本身的TVB-N 值（3.47 mg/100 g 样品）和对照组的TVB-N 值之和。这可能是因为草菇中丰富的蛋白酶[22]导致了牛肉糜中的蛋白质降解，从而产生了额外的碱性含氮物质所致。

表1 草菇对牛肉糜理化性质的影响Table 1 The effect of Volvariella volvacea on the physichemcial of beef paste

添加草菇后牛肉糜的蒸煮损失率（0 和48 h 分别为4.86%和3.44%）显著低于对照组（0 和48 h 分别为21.5%和15.42%）。这可能是因为食用菌中丰富的膳食纤维有助于肉糜水分的保持[23]。与此同时，草菇的处理使牛肉糜的pH 值增加，造成肉糜蛋白间的负电荷增加，蛋白质之间的排斥力增加从而提高肉糜的保水能力[24]。

随着腌制时间的延长，实验组和对照组的pH 值均有所升高。实验组的pH 值（0 和48 h 分别为5.85和6.15）显著高于对照组（0和48 h分别为5.7和5.94），这与之前的研究相一致。Choe 等[25]在乳化香肠中加入金针菇（Flammulina velutipes）后产品的pH 值由6.08提高至6.33，差异显著。Bao 等人[26]也发现在牛肉和鱼肉中添加食用菌提取液，产品的pH 值得到提高。一方面，该现象可能源于草菇中含有较丰富的碱性物质，如精氨酸。另一方面，草菇内源酶会促使牛肉草糜蛋白降解，产生的碱性含氮物质导致pH 值升高。

草菇处理同样会导致牛肉糜色度发生变化。与对照组相比，添加5% Vv 组的肉糜红度（a*值）下降，黄度（b*值）增加。这可能是草菇粉自身色泽所致，而草菇处理48 h 后肉糜的亮度（L*值）和a*值下降，b*值上升，且较对照组（48 h）有显著差异（p＜0.05）。这说明草菇中的多酚氧化酶促进了牛肉糜的氧化，影响了牛肉糜的颜色[27]。此外，Millard 反应和脂质过氧化导致肉糜的非酶褐变[28]，也可能是造成b*值升高和L*值、a*值的降低的重要成因。

2.2 草菇对牛肉糜总蛋白水溶性的影响

肉糜样品随草菇处理时间的延长在不同溶液中的溶解度如图2 所示。S1 是0.5 mol/L 的KCl 溶液，蛋白在盐溶液中的溶解度常常随蛋白结构的改变而变化。添加草菇后，牛肉糜蛋白溶解度随腌制时间的延长而降低，超过36 h 后出现增长。这表明草菇的加入改变了肉糜蛋白的结构和溶解度。S2 是20 mmol/L 的Tris 溶液，S3 在S2 的基础上添加了1%的SDS，SDS作为一种阴离子表面活性剂，能够破坏蛋白间的氢键并削弱疏水作用力[29]。所有样品在S3 溶液中的溶解度明显高于S2，这是因为肉糜蛋白中的氢键被破坏，疏水作用力被削弱，因此牛肉糜蛋白的溶解度增加。其中，添加草菇后牛肉糜蛋白在S3 中的溶解度显著低于对照组。这可能是因为草菇增强了牛肉糜蛋白质之间的氢键和疏水作用力，使其溶解度相对较低。S4在S3 溶液的基础上增加了8 mol/L 的尿素，高浓度的尿素可以进一步破坏蛋白间的氢键和疏水性，使蛋白质的溶解度提高[13]。从图2 中可以看出，对照组在S3和S4 中的溶解度差异相对较小，这表明对照组中的氢键或疏水作用力大部分已经被SDS 破坏，因此尿素对对照组中牛肉糜的蛋白溶解度影响相对较小。然而，实验组在S4 中的溶解度显著高于S3，并且实验组在S4 中的溶解度与对照组在S4 中溶解度差异不大，这是因为高浓度的尿素使蛋白间氢键或疏水作用力被彻底破坏，使实验组和对照组的溶解度位于同一水平。上述研究结果进一步表明草菇与蛋白的相互作用会强化蛋白质分子间的氢键和疏水作用力。

在S4 的基础上，S5 中加入了具有强还原性的β-巯基乙醇，这使蛋白质的氢键和疏水作用力被破坏，同时分子内及分子间的二硫键也被削弱[13]。与S4 相比，样品在S5 中的溶解度显著增加，这是蛋白质中二硫键的断裂、蛋白结构展开导致的[30]。值得注意的是，添加草菇后，牛肉糜蛋白在S5 中的溶解度在36 h前显著低于对照组，这可能是因为草菇的添加使蛋白分子内形成更多的二硫键，造成蛋白的聚集和溶解度的下降。

2.3 草菇对MP 氨基酸侧链的影响

蛋白质中羰基的含量常被用于表示蛋白质氧化程度[30]，羰基形成的方式有：肽键的断裂、外源性羰基的引入、氨基酸侧链的氧化等[31]。如图3a 所示，在腌制初期（0～12 h）对照组的羰基含量与实验组之间没有显著变化。12 h 后实验组MP 的羰基含量开始快速上升，并显著高于对照组，表明草菇促进了肉糜蛋白的氧化。一方面，这可能是因为草菇中丰富的蛋白酶使MP 更多活性基团暴露，造成羰基化程度提高。另一方面，草菇成熟过程中体内会自发表达产生丙二醛（MDA）等氧化物[22]，机械损伤会促使草菇NADPH氧化酶表达[32]，造成MP 的氨基酸侧链被修饰，从而导致羰基含量的增加。

MP 多肽链中巯基具有还原性，很容易被活性氧（ROS）等氧化物攻击而转变为二硫键等。因此，蛋白质中巯基含量的变化被广泛用于衡量蛋白质的氧化程度[30]。如图3b 所示，样品中的巯基含量随腌制时间延长而下降，这说明蛋白质氧化的发生[33]。添加草菇后牛肉糜MP 的巯基含量在整个腌制周期都显著低于对照组。这表明草菇使肉糜MP 的氧化程度升高。Alnoumani 等[34]在研究双胞菇对牛肉糜的影响中发现，4%双胞菇粉未使牛肉糜中巯基显著下降，这主要是因为食用菌干燥过程中使促氧化物浓度升高，促进了肉糜的氧化。

2.4 草菇对肉糜MP 二级结构的影响

使用CD 色谱对MP 的二级结构变化进行分析。如图4 所示，样品的MP 在208 nm 和222 nm 处有两个负峰，这与蛋白质α-螺旋结构肽键的N-π*转移有关[35]。对照组和实验组随着腌制时间的延长，都表现出了α-螺旋含量下降，而β-折叠、β-转角和无规卷曲均出现不同程度的增加。与对照组比较，实验组的α-螺旋含量下降更为明显。值得注意的是，实验组在0 h时α-螺旋甚至低于草菇处理48 h 后MP 的α-螺旋，而β-折叠、β-转角和无规卷曲均高于对照组，这表明草菇促进了肉糜蛋白的氧化。因此，实验组α-螺旋含量的降低可能是由于草菇中存在的氧化物攻击MP 多肽链的氨基酸残基并破坏其氢键造成α-螺旋解旋所致[36]，使得α-螺旋向β-折叠、β-转角和无规卷曲转变[37]。

2.5 草菇对MP 凝胶电泳（SDS-PAGE）的影响

不同腌制时间下样品蛋白的变化采用SDS-PAGE进行分析。MP 作为一种复合蛋白，主要由肌球蛋白重链（MHC）和肌动蛋白（Actin）等组成[38]。如图5所示，空白组各泳道条带间随着腌制时间的延长未见明显变化，而草菇处理后随着腌制时间的延长，蛋白样品在8～10 泳道（24～48 h）点样孔中有大分子聚合物出现。这可能随着腌制时间的延长，氧化程度逐渐加深，诱发蛋白分子聚集导致的。相较于空白组，实验组175～270 ku 间的MHC 和95～130 ku 间的α-Actin随着腌制时间的延长更加暗淡模糊，可能是由于草菇中丰富的蛋白酶诱发蛋白质水解导致的。这也可以从实验组16 ku 附近出现的条带得以证实。综上，草菇会诱发牛肉糜MP 的酶解与氧化聚集。

2.6 草菇对MP 流变性能的影响

储能模量（G'）是指材料在发生形变时，由于弹性形变而引起储存能量的大小变化，反映材料弹性大小[20]。G'的值在40 ℃左右时开始增加，并随着温度的升高而稳定上升（图6）。这主要是由于MP（尤其是肌球蛋白）结构的变化和蛋白间相互作用造成的[39]。当温度上升至75 ℃时，G'值从大到小依次为5%Vv 组（48 h）、对照组（48 h）、对照组（0 h）和5% Vv组（0 h）。腌制初期，添加草菇后肉糜MP 的G'值低于对照组，这可能是草菇中丰富的蛋白酶使肉糜MP部分酶解，对热凝胶结构造成了破坏。然而，随着腌制时间延长，处理48 h 后实验组的G'值高于对照组，这是因为肉糜蛋白的氧化程度增加，形成了蛋白交联增多所致。Kang 等[40]的研究表明，适当的氧化使蛋白间二硫键增多，β-折叠上升，导致蛋白相互交联，从而提高了蛋白凝胶的稳定性。张海璐等[41]通过氧化体系对羊肉凝胶进行处理后，同样发现肉凝胶弹性有所提升。

Tanδ（G''/G'）是耗能模量（G''）与储能模量（G'）的比值，代表着蛋白质凝胶形成过程中“粘度”与“弹性”的相对分布，即Tanδ值越大，材料的粘度越大或弹性越小[42]。样品的Tanδ值从升温伊始便开始降低，这表明随着温度的升高，样品MP 溶液黏度开始增加。根据Samejima 等[43]的论述，当温度大于30 ℃时肌球蛋白的结构“体积”增加，从而产生了更粘稠的溶胶，因此Tanδ值呈现降低的趋势。随着温度继续升高，MP 形成凝胶所需的温度（即Tanδ=1 时的温度）从低到高的顺序依次为5% Vv 组（0 h）、5% Vv 组（48 h）、对照组（0 h）和对照组（48 h）。该现象表明草菇处理的肉糜MP 形成凝胶所需温度相较空白组更低，说明草菇处理后的MP 更易形成凝胶。这可能是因为草菇的加入，草菇处理后MP 分子内的二硫键，从而使MP 溶液形成凝胶所需能量更低[44]。

3 结论

本研究探讨了草菇对牛肉糜蛋白结构及功能特性的影响。研究结果发现草菇可有效降低肉糜的蒸煮损失率，其中富含的蛋白酶和精氨酸等物质会促使牛肉糜的pH 值、色度、TBV-N 值等理化性质发生改变。草菇与肉糜蛋白的相互作用会促进蛋白质的氧化和降解，造成蛋白质巯基向二硫键的转化及α-螺旋结构的解旋，提高蛋白质的凝胶性能。此研究从蛋白质氧化水解层面为解析草菇对牛肉质构及风味的影响提供了一定的理论基础，由于脂质氧化同样是肉制品风味形成的重要因素，草菇内源物对肉糜脂质氧化的调节作用及风味物质的形成规律还有待进一步研究。