白细胞介素18经toll样受体4/髓样细胞分化因子88/核转录因子-κB通路促进支气管平滑肌细胞增殖与迁移

徐慧香，王宁，张美霞，罗丹

（郑州市第九人民医院 儿科，河南 郑州 450053）

支气管哮喘是一种影响气道的慢性炎症性疾病，气道重塑和气道高反应性在支气管哮喘中发挥着重要作用［1］。此外，支气管平滑肌细胞（bronchial smooth muscle cells,BSMC）增殖对气道重塑有很强的促进作用，多项研究证据表明，支气管平滑肌细胞增殖是气道病理重塑的主要影响因素［2］。而且在体外，已显示哮喘患者的支气管平滑肌细胞具有明显的超反应表型，其特征在于通过增加促炎细胞因子和介质［3］，因此，支气管平滑肌的变化对于过敏和炎症反应的表现以及气道壁重塑是必不可少的。白细胞介素（IL）-18 属于IL-1 家族，参与了辅助型T 细胞（Th）2 诱导的多种炎症反应和免疫过程［4］。研究显示，IL-18在哮喘急性发作患者的血清中明显增加，但是IL-18 对BSMC 的影响尚不清楚［5］。Toll 样受体4（TLR4）/髓样细胞分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）易被炎性细胞因子激活，导致细胞炎性因子的增加，且哮喘患者显示支气管组织TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路被激活［6］。对此，本研究采用IL-18 刺激BSMC 增殖，并探讨TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路是否参与其中。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人BSMC 细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物及试剂

细胞计数试剂盒（CCK-8）（上海碧云天生物技术有限公司）；IL-18（美国Sigma Aldrich 公司）；Eritoran（日本卫材公司）；兔抗人TLR4、MyD88、NF-κB p65、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G 二抗（美国Sigma 公司）。

1.3 仪器

倒置荧光显微镜（日本尼康公司）；酶标仪（美国BioTek 公司）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 BSMC 接种到含10% 胎牛血清的DMEM 培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养，胰蛋白酶消化传代。

1.4.2 细胞活力检测 对数期密度为5×104个/mL BSMC 接种于96 孔板，100 μL/孔，24 h 贴壁后弃上清。加入（0.0、0.1、1.0、10.0 ng/mL）IL-18 分别刺激24、48、72 h 后，加入CCK-8 10 μL，培养2 h，于450 nm 测定OD 值（A），计算细胞活力。

1.4.3 体外细胞迁移实验 1×106个/孔BSMC 接种于6 孔板中，加入（0、10 ng/mL）IL-18 分别刺激48 h 后，无血清DMEM 培养基调整细胞密度为1×106个/mL，取100 μL 加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含10%胎牛血清（FBS）的培养基，培养24 h，签刮净滤膜上层细胞，Giemsa 染色，拍照计数。

1.4.4 Western blot 法 1×106个/孔BSMC 接种于6 孔板中，加入（0、10 ng/mL）IL-18 分别刺激48 h后，总蛋白常规提取，二喹啉甲酸（BCA）法测蛋白浓度。20 μL 蛋白样品加样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，并转膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。5%山羊血清封闭1 h，加入一抗（TLR4、MyD88、NF-κB p65 和β-actin 的稀释比例分别为1∶3 000、1∶2 000、1∶2 000 和1∶1 000），4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，凝胶成像系统成像，并进行灰度分析。

1.4.5 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 细胞周期的影响 1×106个/孔BSMC 接种于6 孔板中，将细胞分成：对照组、IL-18 组、IL-18+Eritoran 组，其中IL-18 干预浓度为10 ng/mL，Eritoran 100 nmol/L。依据分组计划，Eritoran 处理2 h 后，加入IL-18继续培养，48 h 后，胰酶消化，1 000×g 离心3 min，加入1 mL 冰浴预冷70%乙醇中，70%乙醇固定24 h，1 000×g 离心3 min。1 mL 冰浴预冷PBS 洗涤后，1 000×g 离心3 min。加入0.5 mL 碘化丙啶重悬细胞，37℃避光温浴30 min，使用流式细胞仪分析DNA 含量。

1.4.6 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 增殖、迁移及TLR4/MyD88/NF-κB 通路的影响 将对数期细胞分成：对照组、IL-18 组、IL-18+Eritoran 组。其中IL-18 干预浓度为10 ng/mL，Eritoran 100 nmol/L，依据分组计划，Eritoran 处理2 h 后，加入IL-18继续培养，48 h 后，采用CCK-8 法检测细胞活力，Transwell 小室检测细胞迁移，Western blot 法检测TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白水平。

1.5 统计学方法

统计学分析采用SPSS 19.0 软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，抑制率比较采用重复测量方差分析，其余采用单因素方差分析，组间比较采用LSD 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-18 对支气管平滑肌细胞增殖的影响

表1 显示，BSMC 细胞吸光度值组间比较，差异有统计学意义（F组间=7.290,P=0.000）；同时随着时间延长，吸光度值呈增长趋势，差异有统计学意义（F时间=85.450,P=0.000）；并且分组与时间有交互作用（F交互=6.910,P=0.000）。其中1 ng/mL作用72 h，10 ng/mL 作用48 h、72 h 细胞活力增加明显，差异有统计学意义（P＜0.05），其中10 ng/mL 作用48 h、72 h 细胞活力最高。

表1 IL-18 对支气管平滑肌细胞增殖的影响（n=3,±s,ng/mL）

表1 IL-18 对支气管平滑肌细胞增殖的影响（n=3,±s,ng/mL）

注：1）与24 h 比较，P＜0.05；2）与24 h 比较，P＜0.01；3）与0 ng/mL 比较，P＜0.05；4）与0 ng/mL 比较，P＜0.01。

2.2 IL-18 对支气管平滑肌细胞迁移的影响

迁移实验提示，对照组穿膜细胞数为（23.53±3.36）；IL-18 组细胞数为（78.34±4.62）；与对照组比较，IL-18 组的细胞数明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 IL-18 对支气管平滑肌细胞迁移的影响（×200）

2.3 IL-18 对支气管平滑肌细胞TLR4、MyD88和NF-κB p65 蛋白水平的影响

与对照组比较，IL-18 组TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 IL-18 对支气管平滑肌细胞TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平的影响

表2 IL-18 对支气管平滑肌细胞TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平的影响（n=3,±s）

表2 IL-18 对支气管平滑肌细胞TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平的影响（n=3,±s）

注：†与对照组比较，P＜0.01。

2.4 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 细胞周期影响

与IL-18 组比较，IL-18+Eritoran 组G1 期细胞百分比明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而S 期、G2 期细胞百分数明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表3。

图3 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 细胞周期影响

表3 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 细胞周期影响（n=3,±s,%）

表3 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 细胞周期影响（n=3,±s,%）

注：1）与对照组比较，P＜0.01；2）与IL-18 组比较，P＜0.01。

2.5 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 增殖、迁移及TLR4/MyD88/NF-κB 通路的影响

与对照组比较，IL-18 组和IL-18+Eritoran 组的吸光度值明显增加，细胞迁移数目明显上调，TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与IL-18 组比较，IL-18+Eritoran 组吸光度值明显降低，细胞迁移数目明显下调，TLR4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图4、图5。

表4 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 细胞TLR4/MyD88/NF-κB 通路的影响（n=3,±s）

表4 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 细胞TLR4/MyD88/NF-κB 通路的影响（n=3,±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.01；2）与IL-18 组比较，P＜0.01。

图4 体外细胞迁移实验（×200）

图5 Eritoran 对IL-18 诱导BSMC 细胞TLR4、MyD88和NF-κB p65 蛋白水平的影响

3 讨论

哮喘是一种慢性支气管炎性疾病，包括支气管的高反应性和支气管壁的局部炎症/增厚，并导致黏液形成和支气管收缩［6］。支气管平滑肌细胞异常增生在气道重塑中起重要作用，部分T 淋巴细胞与BSMC 附着诱导了BSMC 中的DNA 合成，从而增强了其增殖。BSMC 增殖的增强和BSMC 的凋亡减少可能导致气道高反应性［7］。而且有文献显示，支气管哮喘患者的支气管平滑肌细胞分泌的细胞因子比正常人更多，包括一些常见的趋化因子配体［8］。这些细胞因子诱导附着肥大细胞促进肥大细胞的存活和增殖，促进炎症物质的积累，增加平滑肌并导致气道高反应性。

有几种细胞因子和趋化因子参与哮喘的病理生理学。细胞因子与其靶细胞的膜特异性受体结合并触发改变这些靶细胞中基因表达的信号转导途径［9］。目前，细胞因子被认为是哮喘的治疗靶点，并且一些特定的抗细胞因子，如IL-5 抗体，已被批准用作严重哮喘的治疗选择［10］。IL-18 为IL-1 家族成员，主要由巨噬细胞、NK 细胞或T 细胞产生，具有双向作用，可以通过诱导分泌γ-干扰素（IFN-γ），提高Th1 免疫应答。同时其还能诱导IgE，加强炎症反应，诱导Th2 的分泌。而且哮喘急性发作的患者的血清中的IL-18 水平明显高于健康对照组，且治疗前血清IL-18 水平明显高于治疗后的水平［11］。这些都说明IL-18 水平的增加可能与哮喘有关，并有可能参与了支气管平滑肌细胞的增殖和迁移。本研究中，结果证实了IL-18促进了支气管平滑肌细胞的增殖和迁移。

TLR4/MyD88/NF-κB 通路与炎症的发生和发展关系密切，TLR4 的激活，诱发MyD88 启动细胞信号转导，可以说MyD88 在整个通路中扮演着重要的角色，是转导下游信号的靶分子。NF-κB 为MyD88 下游的信号分子，通过对NF-κB 的激活，启动下游的炎性细胞因子的表达，促进机体的炎症反应［12］。在本研究中，结果显示IL-18 促进了TLR4/MyD88/NF-κB 通路信号分子的表达水平，加强了细胞的炎性反应，从而诱导支气管平滑肌的增殖。而采用TLR4/MyD88/NF-κB 通路抑制剂Eritoran 抑制TLR4 的表达水平，影响了MyD88 诱导下游的基因水平，降低NF-κB p65 表达水平，抑制NF-κB 的活化，降低促炎因子水平，协调免疫系统的活化，并阻断了IL-18 诱导BSMC 的增殖和迁移。这些都说明IL-18 通过TLR4/MyD88/NF-κB通路促进了平滑肌细胞增殖和迁移。

综上所述，IL-18 可能通过TLR4/MyD88/NF-κB通路中信号分子的表达，促进了平滑肌细胞增殖和迁移，这也为支气管哮喘基因治疗提供新的靶点。