耙耙柑果酒发酵工艺研究

刘 建，吴华昌，邓 静，刘 阳

（1.仲恺农业工程学院，广东广州 510230；2.四川旅游学院，四川成都 610199）

耙柑学名春见柑橘，品皮薄，果皮与肉质分离。川渝地区俗称“软”为“耙”，故称耙耙柑，其果肉为橙色，肉质脆嫩、多汁、囊壁薄、化渣，糖度高，风味浓郁，清甜，少籽与无籽。柑橘果肉中含有丰富的氨基酸、维生素、微量元素等多种健康因子，耙耙柑含糖在14 %以上，酸度为1 %左右，油富含人体所需的维C、铁、钙、磷、柠檬酸、维生素C、胡萝卜素等，可溶性固形物14.5%，具有止咳化痰、润肠去火、排毒养颜、疏肝健脾等多重功效。

耙耙柑作为四川特色水果，种植面积和种植量较大，但由于季节性成熟，耙耙柑滞销严重，导致耙耙柑资源浪费严重。因此，本研究旨在利用耙耙柑发酵制作成果酒，既能增强口感，降低酒精度，满足营养需求，又能增加耙耙柑加工途径，丰富耙耙柑加工产品。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 原料耗材及试剂

耙耙柑，产地为四川眉山；果胶酶，柚苷酶，蔗糖，活性炭，柠檬酸，氢氧化钠，酚酞指示液，葡萄糖，购于成都金山化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器设备

BT42 超纯水机，上海睿析科学仪器有限公司；QYC-2102C 型恒温培养箱，上海福玛实验设备有限公司；EK328 香山电子称，广东山衡器集团股份有限公司；CJJ0003 电磁搅拌器，金坛新瑞有限公司；LC20012598 手持酸度计，上海力辰有限公司；H032333糖度仪，北京元速动力科技有限公司；ZL-511ATC 手持酒精折光仪，四川中浪科技有限公司；京制00000113 号紫外可见分光广度计，北京莱伯泰科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

耙耙柑→去皮核→榨汁→酶解→过滤→脱苦→装瓶→发酵→取液→灭菌装瓶

1.2.2 操作要点

原料的选取和处理：选用新鲜饱满成熟的耙耙柑，人工剥皮，尽量去掉白色橘络，以防止苦味物质的增加。耙耙柑榨汁前加入0.1 %的柠檬酸，防止耙耙柑汁液变色。酶解时加入0.2%的果胶酶搅拌均匀，在烧杯口盖上保鲜膜，放入45 ℃的水浴锅内静置1 h。酶解后加入0.12 %的柚苷酶搅拌均匀，在烧杯口盖上保鲜膜，放入50 ℃的水浴锅内静置2 h。在发酵前，加入适量的蔗糖，调节糖度为一定值，再加入0.03 %活化好的干酵母，搅拌均匀。最后放入恒温箱内，调制一定的温度，进行发酵。

1.2.3 前处理优化工艺

目前柑橘果酒产业化加工较少，主要原因是柑橘加工后会产生苦味。这类苦味物质严重影响了柑橘果酒的口感,给消费者带来不愉快的体验，对感官评分产生影响。榨汁后加入果胶酶，用柚苷酶或活性炭对果汁进行脱苦，以感官评定为依据判定最佳的果胶酶用量和脱苦方式。

1.2.4 发酵工艺条件单因素实验

初始发酵条件：12 %蔗糖添加量，0.02 %酵母添加量，24 ℃发酵温度，6 d 发酵天数，改变其中一个因素，固定其他工艺参数，最终以酒精度、感官评分、透光率、可溶性固形物、糖酸比、pH 值等数据进行结果分析。其中发酵天数设置2 d、4 d、6 d、8 d、10 d 共5 个梯度；糖度梯度设置4 %、8 %、12 %、16 %、20 %共5 个梯度，酵母量添加量0.01 %、0.02 %、0.03 %、0.04 %、0.05 %共5 个梯度；发酵温度设置22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃共5 个梯度。

1.2.5 感官指标

选十位经过感官培训的专业感官评价人员对果酒进行评分，鉴评人员按照表1 的感官评分标准对样品进行独立评分并记录。

表1 感官评价标准

1.2.6 评定指标测量方法

酒精度：酒精度折光仪检测。

总糖的测定：按GB/T 15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中规定测定。

透光率的测定：利用紫外可见分光光度计选择透光率，波长设定为680 nm进行测定。

1.2.7 发酵工艺优化

在单因素试验结果基础上，选择以发酵温度（A）、发酵时间（B）、初始加糖量（C）和酵母接种量（D）为自变量，以耙耙柑果酒的酒精度（Y）、感官评分（Y）为响应值，采用响应面法进行优化，筛选出果酒的最佳发酵工艺条件。

2 结果与分析

2.1 发酵前处理优化

2.1.1 果胶酶酶解用量的优化

当不添加果胶酶时，耙耙柑果汁浑浊，含有大量的上层不溶性沉淀，影响果酒酒体的外观。随着果胶酶添加量的增加，果胶酶能分解细胞内的果胶质，液体逐渐澄清透明，上层的不溶性沉淀减少，有明显的分层现象，有益于后期的过滤，增加出汁率。当果胶酶添加量为0.3 %时，果汁变得澄清透明，分层明显，因此选择果胶酶含量在0.3 %最为合适。

2.1.2 脱苦方式的选择

耙耙柑在加工生产的时候会出现苦味物质加重的情况，这也是制作产品时一个比较重要的问题。新鲜成熟的耙耙柑鲜食并无明显苦味，工业榨汁后，释放出了柚体或者果皮内的苦味物质，使其带有大多数人无法接受的苦味。通过查找资料得知，主要的苦味物质为柠檬苦素和柚皮苷等物质，除掉其中的苦味物质，常用方法为吸附法和酶解法等。本实验分别比较了物理法脱苦和酶法脱苦，实验材料分别为活性炭和柚苷酶，通过感官评价比较，酶法脱苦优于物理脱苦，所以脱苦方式选择酶法脱苦。

表2 果胶酶用量对耙耙柑果酒的影响

表3 脱苦方法的比较

2.2 发酵时间对耙耙柑果酒品质的影响

由表4可知，pH值、糖酸比、可溶性固形物随着发酵时间的延长均在下降，发酵时料液中的酵母菌将糖转化为酒精，可溶性固形物和总糖被消耗，同时料液中的微生物也在产酸。发酵时间越长酒体越澄清，所以透光率越高。酒精度和感官是评价发酵时间最重要的指标，如图1所示。

表4 发酵时间对各项理化指标及感官评分的影响

图1 发酵时间对耙耙柑果酒品质的影响

酒体的酒精度、主体风味及色泽的形成主要是在主发酵阶段。由图1 可以看出，2～6 d 发酵时，感官评分较低，酒精度数一直在上升，发酵天数不足还未发酵彻底；随着发酵天数的增加，耙耙柑果酒的酒精度以类似直线的增长率持续上升，可能是酵母一直在发酵，即便酒精度的增加会抑制酵母的发酵，但不会完全抑制，还是会有一部分酵母产出乙醇。发酵天数为6 d 时，耙耙柑果酒的感官评分最高，此时产品的品质最好，并且酒精度也控制在一个合理的量，果酒的口感最好。随着发酵天数的增加，在6～10 d 风味逐渐下降，可能是出现了轻微的酸败现象，抑制了果酒酵母产生酒精的能力，并且产酸使果酒感官品质大大降低。综合考虑选择6 d 为最佳发酵时间，同时发酵时间对整个发酵过程影响并不明显，所以不作为响应面因素。

2.3 发酵温度对耙耙柑果酒品质的影响

由表5 可知，糖酸比、可溶性固形物、总酸，随着发酵温度的升高均在下降，发酵时料液中的酵母菌因为温度升高将料液中的糖转化为酒精的速率增加，可溶性固形物和总糖被消耗速率加快，料液中的微生物产酸速率也加快。发酵温度越高酒体越澄清，所以透光率越高。酒精度和感官是评价发酵温度最重要的指标，如图2所示。

表5 发酵温度对各项理化指标及感官评分的影响

图2 不同发酵温度对耙耙柑果酒品质的影响

酵母菌之所以能够正常繁殖生长发酵，适当的温度起着很大的作用。温度太低，酵母几乎不会发芽或者以十分缓慢的速度发芽繁殖；在适应的温度范围内，酵母能够快速的发芽繁殖到最高细胞数，并且充分的进行发酵。由图2 可以看出，发酵温度对耙耙柑果酒酒精度和感官品质的影响较显著。当发酵温度为21～24 ℃时，果酒的品质随酒精度的上升而上升；24 ℃时果酒品质、酒精度达到较好水平；24 ℃时酒精度的增长速度最快，但24～33 ℃品质开始下降，可能是过低和过高的温度，酵母的发酵减缓，低温抑制酵母发芽数，高温抑制酵母发酵。综合考虑选择24 ℃为最佳发酵温度。

2.4 酵母接种量对耙耙柑果酒品质的影响

由表6可知，pH值、糖酸比、可溶性固形物随着酵母接种量的增加均在增加。发酵时料液中的酵母菌接种量增加，料液中的糖转化为酒精速率也增加，可溶性固形物和总糖被消耗速率加快，料液中的微生物产酸速率也加快。酵母接种量在0.03 %时透光率最高。酒精度和感官是评价酵母接种量最重要的指标，如图3所示。

表6 酵母接种量对各项理化指标及感官评分的影响

图3 酵母接种量对耙耙柑果酒品质的影响

由图3 可知，耙耙柑果酒的酒精度和感官评分都有明显变化。在酵母接种量0.01 %时酒精度和感官评分都最低，说明此时酵母接种量过少发酵未彻底，酒精度和果酒品质偏低；随着酵母接种量的增加，在0.02 %时果酒品质最好；继续增加酵母接种量，酒溶液中含糖量下降，酸度上升，可能是接种密度过大，导致发酵液中溶氧不足，抑制了酵母的生长，不利于香气物质的形成，口感变差。添加0.03%酵母接种量时酒精度为最高，随着添加量的增加酒精度减少，此时发酵液中糖含量最低，无法被酵母转化成酒精。综合考虑选择0.02 %酵母接种量为最适酵母接种量。

2.5 初始加糖量对耙耙柑果酒品质的影响

由表7可知，pH值、糖酸比、可溶性固形物随着糖度的增加均在增加。发酵时料液中初始加糖量增加，料液中更多的糖能转化为酒精，酒精度也更高，可溶性固形物和总糖在发酵完成后残留量也更多，料液中的微生物产酸速率也加快。初始加糖量在12%时透光率最高。酒精度和感官是评价初始加糖量最重要的指标，如图4所示。

表7 初始加糖量对各项理化指标及感官评分的影响

图4 不同初始加糖量对耙耙柑果酒品质的影响

不同的初始加糖量会影响耙耙柑果酒的发酵和酒精度的含量，适当浓度可以增强酵母的发酵，使果酒的风味更好，结果见图4。由图4 可知，初始加糖量对耙耙柑果酒的酒精度和品质有明显的影响，总体呈现上升的趋势。在初始浓度为12%时，耙耙柑果酒的品质达到最高值，酒精度也相对平稳。继续增加糖度，酒精度越来越高，高浓度的糖分和酒精度会抑制耙耙柑果酒酵母的发酵作用，并且过高的酒精度会影响果酒的风味。因此，在12%～20%的糖度下，酒精度明显加强，但果酒最终的品质下降。因此调节耙耙柑汁的最佳糖度为12%。

2.6 发酵工艺优化

根据据单因素试验得出的结果，最佳发酵工艺条件为发酵时间6 d，发酵温度24 ℃，酵母接种量0.02%，初始加糖量12%。由于发酵时间对发酵结果影响不明显，所以根据单因素试验结果以酵母添加量（A），初始加糖量（B）及发酵温度（C）为影响因素，以酒精度（Y）和感官评分（Y）为响应值，利用DesignExpert8.06 响应面软件的Box-Behnken 试验设计3因素3水平试验，见表8。

表8 Box-Behnken试验设计因素与水平

试验设计结果与分析见表9，方差分析结果见表10、表11。对获得的数据利用分析软件Design-Expert 进行多元回归方程拟合，得酒精度（Y）和感官评分（Y）二次多项回归模型方程为：

表9 Box-Behnken试验设计结果与分析

由表10 和表11 回归模型方差分析结果可知，以响应面法建立的二次回归模型方程，两个模型都为极显著（P＜0.01），而且失拟项都为不显著（P＞0.05），未知因素对试验结果干扰不大。酒精度和感官评分的校正决定系数R为97.04%和99.29%，说明该模型的拟合程度比较好，采用响应曲面法优化建立的耙耙柑发酵工艺回归方程（模型）是有效的，可以用来确定耙耙柑发酵果酒酿造的最佳发酵工艺。以酒精度（Y）为响应值时，一次项C 和交互项AB 影响显著，A、A、B、C影响都为极显著，由F检验可以得到的因子贡献率为A＞C＞B；以感官评分(Y)为响应值时，一次项C、交互项AB、AC、BC 和二次项A、B、C影响极显著，由F 检验可以得到因子贡献率为C＞B＞A。

表10 回归模型方差分析

表11 回归模型方差分析

各因素对指标影响的响应面及等高线结果见图5。由图5 可知，在Y模型中BC、AC 交互作用不显著，所以对AB 交互作用进行分析，在保持发酵温度恒定的情况下，酒样品中的酒精含量首先增加，随着初始糖含量和酵母数量的增加而降低，且所述等高线为椭圆形，具有极端值，弯曲表面是相对陡峭的，交互显著。在Y模型中等高线最小椭圆的中心点为响应面的最高点，即感官评分最高，等高线的形状为椭圆形，曲面倾斜度越高，坡度越陡，各因素对感官评分的影响越显著，说明AC、BC、AB 交互作用显著。使用响应面优化分析方法分析回归模型，选择酒精含量和感官评分的重要性为5，分别选择酒精含量和感官评分的最大响应值。寻找最优响应结果为酵母添加量0.022 %，初始加糖量12.20%，发酵温度23.95℃。此优化条件下发酵后果酒酒精度预测值为11.22%vol，感官评分预测值为83.27 分。为验证试验结果的真实性，考虑实际的操作情况，将发酵工艺参数调整为酵母添加量0.02%，初始加糖量12 %，发酵温度24 ℃。在此发酵工艺条件下，进行6 次验证试验，耙耙柑果酒的感官评分实际值为80.25 分，酒精度实际值为11.05 %vol，与预测值相差较小，证明该回归模型可行，应用响应面得出的最佳耙耙柑果酒发酵工艺可行。

图5 初始加糖量、酵母接种量、发酵温度交互作用对耙耙柑果酒感官评分和酒精度的响应面及等高线图

2.7 耙耙柑果酒的最佳工艺品质

通过单因素试验和响应面试验对耙耙柑果酒发酵工艺进行优化处理，最终得到产品的感官指标：澄清透亮、有光泽、橙黄色，香气协调、优雅，具有明显的柑橘果香与酒香，酒体丰满，醇厚协调，舒服爽口，回味延绵，有柑橘的风格，典型性良好。理化数据见表12。

表12 耙耙柑果酒理化指标

3 结论

以耙耙柑为主要原料，经过榨汁、酶解、脱苦、发酵等步骤制作成耙耙柑果酒，前处理优化使用柚苷酶脱苦。单因素实验中，保持其他因素不变，最终得出调节耙耙柑汁的最佳糖度为12 %，最佳的发酵时间6 d，酵母量添加在0.02%为最佳，最佳发酵温度为24 ℃；根据单因素试验结果进行响应面试验得出最佳发酵工艺：酵母量0.02 %、初始加糖量12%、发酵天数6 d、发酵温度24 ℃下，果酒的品质最好。通过本研究，为耙耙柑果酒的工业化生产奠定了一定基础。