宏基因二代测序对结缔组织病并发免疫抑制宿主肺炎患者的病原学分析

张安兵 袁小玲 夏秀琼 吕燕华 张丹丹 梁剑平

近年来，随着诊疗技术不断提高，结缔组织病(Connective tissue disease，CTD)发病率也越来越高，患者死于原发病的比例逐年下降[1]。但是，由于病人的生存时间延长及糖皮质激素、免疫抑制剂的长期使用，合并肺炎患者的比例也逐渐升高[2]。因该类患者免疫力低下，感染特殊、罕见病原体较多，临床经验性抗感染治疗难度大，传染病原学检测方法耗时长、阳性率不高。因此，临床上亟需新的检测方法来快速、准确诊断感染病原体，为临床“靶向”抗感染治疗提供客观依据。宏基因二代测序技术(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)被逐渐应用于临床病原体检测，现将我科近3年结缔组织病并发免疫抑制宿主肺炎患者的临床资料进行mNGS结果分析，从而概括出该类患者的病原学分布，旨在为这类患者早期经验性抗感染治疗提供参考。

资料与方法

一、研究对象

选取符合入选标准的我院呼吸与危重症医学科2019年1月至2021年7月收治的结缔组织病并发免疫抑制宿主肺炎患者为研究对象。

纳入标准：①符合2019年美国感染病学会/美国胸科学会(IDSA/ATS)“成人社区获得性肺炎诊治指南”对社区获得性肺炎的诊断标准[3]；②所有患者均诊断为结缔组织病；③患者使用糖皮质激素和(或)免疫抑制时间≥1个月；④年龄≥18岁。

排除标准：①结缔组织疾病累及肺部；②患获得性免疫缺陷综合征者；③粒细胞缺乏者；④严重肝功能、肾功能损害者；⑤合并急性心力衰竭者；⑥合并各种肿瘤；⑦妊娠或哺乳期妇女；⑧存在纤支镜检查禁忌症者。

二、研究方法

将符合入选标准的32例患者纳入研究，所有患者均完成纤支镜肺泡灌洗术；患者肺泡灌洗液样本均干冰保存送至广州达安临床检验中心行mNGS检测，mNGS标本的采集、保存和运输均按照该公司标准化规范执行。

收集患者性别、年龄、体重指数(BMI)、吸烟史、基础疾病、使用免疫抑制剂情况、血常规白细胞计数(WBC)、血常规中性粒细胞比例(N%)、胸部CT结果、肺炎严重指数评分(PSI评分)等一般资料(见表1)。收集患者肺泡灌洗液mNGS及传统检测方法病原学结果并进行回顾性分析。

三、统计学方法

结 果

一、患者一般情况

32例患者中，女性25例(78.13%)，男性7例(21.87%)，年龄25岁～78岁，平均年龄(56.72±11.75)岁，有吸烟史者9例，BMI(21.23±3.45)kg/m2。32例患者中系统性红斑狼疮9例(28.12%)，干燥综合征6例(18.75%)，硬皮病5例(15.63%)，皮肌炎5例(15.63%)，变应性血管炎4例(12.50%)，类风湿性关节炎3例(9.37%)。32例患者中仅使用激素治疗者23例，同时使用激素和其他免疫抑制剂者9例；激素、免疫抑制剂使用时间1～3个月的11例，3个月以上的21例。患者WBC(15.63±4.53)×109/L，N%(87.87±8.63)%，CRP(93.68±10.26)mg/L，PCT(1.83±0.73)ng/mL，PO2(85.21±7.97)mmHg，PSI评分(63.58±9.76)。32例患者中病变为实变影9例(28.12%)，磨玻璃样影6例(18.75%)，斑片影6例(18.75%)，混合改变11例(34.38%)。

二、患者mNGS与传统检测方法病原学结果比较

32例患者中有28例肺泡灌洗液mNGS检测阳性(检出率87.50%，95%CI为1.354～16.936)，其中细菌15例(46.88%，阴性菌12例、阳性菌3例)；真菌13例(40.63%，其中耶氏肺孢子菌6例、曲霉菌3例、白色念珠菌2例、光滑念珠菌2例)，均为激素或免疫抑制剂使用时间3个月以上的患者；病毒7例(21.88%，其中巨细胞病毒4例、人类疱疹病毒2例、呼吸道合胞病毒1例)，均为激素或免疫抑制剂使用时间3个月以上的患者，该7例病毒感染均为与其他细菌或真菌的混合感染(见表1)。

32例患者中有19例患者传统病原学检测阳性(检出率59.37%，95%CI为0.303～2.829)，其中培养出细菌11例(34.37%)，培养出真菌8例(25%)，G实验和(或)GM实验8例阳性(25%)，病毒核酸或病毒抗体检测6例阳性(18.75%)(见表1)。

表1 患者病原学检查结果

肺泡灌洗液mNGS病原学检测阳性率明显高于传统检测方法(87.50% vs 59.37%，χ2=6.488，P=0.01)(见表2)。

表2 两组患者病原学检测阳性率比较

讨 论

结缔组织病(CTD)是一组系统性自身免疫性疾病，糖皮质激素和免疫抑制剂是其常规治疗药物，该类药物长期使用不同程度抑制了患者的免疫力，增加感染风险，肺部感染最为常见[4-5]。合并免疫抑制宿主肺炎患者感染病原体往往为罕见或特殊病原体，部分患者存在混合感染，这类患者往往经验性抗感染治疗效果不佳，病原学诊断困难[6]。传统病原学检测方法阳性率低、培养周期长，难以指导临床抗感染治疗，宏基因二代测序(mNGS)作为一种新的病原学检测方法逐渐应用于临床。

mNGS能一次性并行对几百万条DNA分子进行序列测定，能够检测出可培养和不可培养微生物的基因序列，绕过了微生物的分离和培养过程，具有病原体检出阳性率高、灵敏性及特异性高等特点，且不受宿主因素、激素使用的影响[7-10]。因此，我们试图探讨mNGS技术对结缔组织病合并免疫抑制肺炎病原体检测的应用价值

本研究中肺泡灌洗液mNGS病原体检测阳性率达87.5%，明显高于传统检测方法阳性率59.37%(χ2=6.488，P=0.01)。林明珍等[11]报道mNGS对初治失败的社区获得性肺炎病原体检测阳性率明显高于传统检测(85.06% vs 8.04%，P<0.05)。钮月英等[12]报道肺泡灌洗液mNGS对下呼吸道感染病原体检测的阳性率高于传统培养(69.6%vs25.0%，P<0.05)，mNGS阳性结果调整抗感染药物后治疗效果，明显好于经验性抗感染治疗(88.0%vs40.0%，P<0.05)。据谢栓栓等[13]报道mNGS诊断病原体阳性预测值(91.23%)和阴性预测值(30.56%),显著高于培养法诊断病原体的阳性预测值(87.50%)和阴性预测值(18.84%)。对于mNSG检测病原体阴性的患者，可尽早开始肺活检排除其他疾病可能。

本研究mNGS检测结果显示免疫抑制宿主肺炎患者感染病原体占比由高到低，依次为细菌、真菌、病毒。细菌中以革兰阴性菌为主，占比80%，与郭娇等[6]报道的88.89%相似，革兰阴性菌中又以铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌为主，革兰阳性菌以金黄色葡萄球菌为主。因此，这类肺炎患者经验性调整抗感染时，可考虑抗铜绿假单胞菌的β-内酰胺类药物、氟喹诺酮类药物，必要时加用覆盖金黄色葡萄球菌的万古霉素或替考拉宁、利奈唑胺。本研究中所有真菌感染者激素、免疫抑制使用时间，均超过3个月，Ford E.S.等报道[14]泼尼松15～20mg/d使用超过3周的患者发生耶氏肺孢子菌肺炎的风险显著增加，本研究中耶氏肺孢子菌占真菌感染比例高达46%(6例)，曲霉菌15%(3例)；贾建超等[15]报道20例重症真菌肺炎患者mNGS检测检出肺孢子菌55%(11例),曲霉菌30%(6例)，与我们的研究结果相似。因此，对于激素和(或)免疫抑制剂使用时间超过3个月的患者，应当常规检测G试验、GM试验，并考虑是否开始抗真菌治疗，临床上可予伏立康唑联用复方磺胺甲噁唑，经验性覆盖肺孢子菌、曲霉等真菌。免疫功能受损患者易合并病毒感染，本研究中检出病毒感染7例，巨细胞病毒占检出病毒比例达57%，这些患者激素或免疫抑制剂使用时间均超过3个月，且胸部CT均存在磨玻璃样阴影；对这些患者经验性抗感染治疗效果欠佳时，应考虑巨细胞病毒、人类疱疹病毒感染可能；对此类患者应常规行病毒核酸或抗体检测，若结果阳性，应予更昔洛韦抗病毒治疗。本研究中7例病毒感染均为与细菌或真菌的混合感染；姚仲伟等[16]报道在复合感染中mNGS对病原体的诊断效能明显高于传统培养(58.6%vs.27.6%，P=0.017)。

综上所述，结缔组织病合并免疫抑制宿主肺炎患者，病情复杂，早期进行肺泡灌洗液mNGS检测，可快速明确致病病原体，从而针对性选择抗感染药物，以便提高患者治疗成功率、减少抗感染药物使用种类。我们也期待大样本量的前瞻性研究能够为这类患者的抗感染治疗提供更多证据。