丛枝菌根真菌对枸杞生长及抗根腐病的影响*

2022-07-28李柄霖丁德东李彦湘赵吉桃候彩霞

云南农业大学学报(自然科学) 2022年4期

李柄霖，丁德东，何静，李彦湘，赵吉桃，候彩霞，赵倩

(甘肃农业大学林学院，甘肃兰州 730070)

枸杞(Lycium bararum)为茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)多年生落叶灌木，具有抗衰老、抗癌症、降血糖、降血脂、免疫调节和保护神经系统等多种功能[1]。中国有7个种和3个变种，主要分布在宁夏、甘肃和青海等地[2]。据报道，真菌性病害对枸杞植株的危害最大，主要有根腐病、叶枯病和灰斑病等，其中枸杞根腐病是最主要的病害之一[3]。

根腐病作为世界性作物病害，是一种危害极大的维管束系统病害，主要危害植株茎部和根部，其致病因素复杂，潜伏期长，不易被发现，导致其防治药剂的选择存在一定困难。发病初期植株叶片发黄，枝条萎缩，根部呈褐色，随后根系腐烂；后期外皮脱落，只剩木质部，剖开病茎可见维管束变为褐色，严重时枝条或全株枯死[4-5]。目前，植物根腐病的防治主要以化学防治为主，但常造成农药残留、环境污染以及危害人类健康等问题；此外，还易使病原菌产生抗药性，严重影响枸杞品质。因此，如何安全、高效地防治根腐病，已成为枸杞生产中亟待解决的问题之一。

近年来，采用生防微生物促进植物生长并提高其抗病性的研究备受关注，如丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal，AM)真菌[6]。AM真菌是陆地生态系统的主要成员之一，存在于不同类型生态环境中，能够与80%的陆生植物根系形成互惠共生体，通过其强大的菌根、菌丝网络促进宿主植物根系对土壤水分和养分的吸收，提高植物抗病性，促进植物生长，在一定程度上缓解逆境胁迫带来的损伤，对生态系统植被恢复有重要作用[7-8]。同时，AM真菌具有广泛的生物活性，能够抑制真菌、细菌和病毒等植物病原微生物的侵染或生长，从而发挥提高植物抗病性的作用[9]。当前，利用AM真菌开展根腐病等土传病害的生物防治已成为植物与微生物领域的研究热点。根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices)是AM真菌家族的重要成员，已有报道其具有显著提高芦笋根系相关防御酶活性、增强植株对病原菌抗性的作用[10]，但其作为生防微生物能否对枸杞根腐病产生抗性尚不明确。本研究以枸杞实生苗为试材，通过盆栽试验，设置不同接种处理，探究根内根孢囊霉对枸杞植株的促生作用及抗根腐病能力的影响，旨在为利用根内根孢囊霉开展枸杞根腐病的生物防治提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试AM真菌：根内根孢囊霉(R.intraradices)，编号为BGC-BG09，原始菌种购自北京市农林科学院植物营养与资源研究所。经玉米扩繁后，制成含有沙土、可侵染根段和孢子(每克菌剂约30个)的混合物作为接种材料。

供试病原菌：根腐病主要致病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)分离自枸杞根腐病病株，由甘肃农业大学森林保护实验室提供，试验前7 d在PDA培养基上经活化处理后备用。参考王倡宪等[11]的方法制备菌悬液。

育苗基质：沙壤土和营养土按1∶1 (质量比)混合，并在121 ℃下灭菌2 h，冷却后备用。

供试植株：供试枸杞植株为宁杞1号3年生实生苗，购自甘肃省景泰县枸杞主产区。

1.2 试验设计与方法

采用盆栽试验，将灭菌后的土壤装入36 cm×22 cm×15 cm (高×外径×内径)的花盆内，每盆8.5 kg。试验共设置4个处理：(1) 不接种微生物(对照组，CK)；(2) 单接种病原菌腐皮镰刀菌 (FS)；(3) 单接种根内根孢囊霉 (RI)；(4)接种根内根孢囊霉后再接种腐皮镰刀菌 (RI+FS)。RI和RI+FS处理在3月上旬移栽的同时将根内根孢囊霉菌剂均匀地撒在枸杞植株须根部，与须根充分接触，施用量为每株10 g；CK处理按同样的方法接入10 g灭活菌剂作为对照，移栽后保持水分正常供应。4月下旬根内根孢囊在枸杞根系成功定殖，而后采用伤根法，用100 mL腐皮镰刀菌孢子悬浮液(105CFU/mL)进行灌根处理，CK组以等量无菌水进行灌根处理。分别于菌根菌接种成功后30 d (花期)、60 d (初果期)、90 d (盛果期)和120 d(末果期)测定枸杞根系侵染率。每处理9盆，每3盆为1个重复，共36盆，随机区组设计。试验期间，保持各植株正常水肥管理。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 发病率和病情指数

接种病原菌后对枸杞植株进行实时调查，待枸杞表现出发病症状后，每天调查1次枸杞叶片的发病情况，记录发病叶片数，计算发病率：发病率=(发病植株的株数/总株数)×100%。根据标准对病情进行分级。0级：叶片无症状，根茎部无病斑，无腐烂症状；1级：叶片黄化面积不超过叶片总面积的5%，根茎部出现病斑，茎基部表皮有褐变，褐变面积小于5%，根部腐烂程度不超过15%；2级：叶片黄化面积占叶片总面积的5%～20%，根部病斑扩大，根茎部表皮褐变、组织腐烂坏死，褐变面积为6%～30%，根部腐烂程度为15%～30%；3级：叶片黄化面积占叶片总面积的20%～50%，根部病斑继续扩大，根茎部表皮明显褐变，褐变面积为30%～50%，根部腐烂程度在30%～50%之间；4级：叶片黄化面积占叶片总面积的50%～75%，根部明显腐烂，茎基部完全变褐，褐变面积大于50%；5级：叶片黄化面积大于75%，植株枯死。按以下公式计算病情指数和防治效果[12]：

病情指数=[∑(各级病叶数×相对应级数值)/(总叶数×最高级值)]×100；

防治效果=(FS处理病情指数-RI+FS处理病情指数)/FS处理病情指数×100%。

1.3.2 枸杞形态指标、叶绿素含量和菌根侵染率的测定

接种根内根孢囊霉90 d后发现枸杞植株的侵染率达到最大值，故此时收获枸杞植株用于测定形态指标。用卷尺和游标卡尺分别测量苗木株高和基径；收获后称其鲜质量，121 ℃杀青后于烘箱中65 ℃烘干至恒质量，称量后为其干质量；叶绿素含量采用丙酮浸提法测定[13]；采用醋酸墨水法[14]对菌根染色，并在生物显微镜(奥特光学BK6000)下观察菌根定殖情况，计算菌根侵染率：侵染率=(侵染的根段数/检测根段数)×100%；根内根孢囊霉孢子密度采用湿筛倾析法测定[15]。

1.3.3 抗病相关酶活性的测定

接种根内根孢囊霉90 d后，称取鲜叶0.2 g，用锡箔纸包装后经液氮速冻置于-80 ℃超低温冰箱保存，用于测定抗病相关酶活性。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)采用氮蓝四唑(NBT)法测定；过氧化物酶(peroxidase，POD)采用愈创木酚比色法测定[16]；苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammomia lyase，PAL)采用紫外分光光度法测定；多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)采用邻苯二酚氧化法测定[17]；过氧化氢酶(catalase，CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)参考NAKANO等[18]的方法测定。

1.4 数据处理与分析

试验数据用Microsoft Excel 2019进行整理和作图，用IBM SPSS 26.0进行单因素one-way ANOVA方差分析，用LSD法进行显著性检验。数据均用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 接种根内根孢囊霉对枸杞根腐病发病率及病情指数的影响

由表1可知：与FS处理相比，RI+FS处理的发病率和病情指数分别降低55.56%和62.79%，防治效果达到63%。说明接种根内根孢囊霉可降低根腐病的发病率，增加枸杞的抗病性，减轻根腐病危害程度。

表1 不同接种处理下枸杞根腐病发病率、病情指数及防治效果Tab.1 Incidence rate,disease index and control effect of Lycium barbarum root rot under different inoculation treatments

2.2 接种根内根孢囊霉对枸杞形态指标的影响

由表2可知：与FS处理相比，除CK外其他处理的枸杞株高、茎粗、干质量及鲜质量均显著增加(P<0.05)。与CK相比，RI处理的株高增加54.86%、茎粗增加35.94%、鲜质量增加126.91%、干质量增加148.18% (P<0.05)。说明接种根内根孢囊霉可增加枸杞生物量，促进枸杞生长。

表2 不同接种处理对枸杞生长参数的影响Tab.2 Effects of different inoculation treatments on the growth parameters of L.barbarum

2.3 接种根内根孢囊霉对枸杞叶绿素含量的影响

由表3可知：与CK相比，RI处理的枸杞叶绿素a和总叶素含量分别显著提高80.15%和57.14%(P<0.05)，叶绿素b含量提高30.77%。相较于FS处理，RI+FS处理的叶片叶绿素a和总叶绿素含量分别显著提高155.56%和85.01% (P<0.05)，叶绿素b含量增加27.27%。说明接种根内根孢囊霉可提高枸杞植株对光能的利用。

表3 不同接种处理对枸杞叶绿素含量的影响Tab.3 Effects of different inoculation treatments on chlorophyll content of L.barbarum mg/g

2.4 枸杞根系菌根定殖情况

由图1可知：根内根孢囊霉成功侵染枸杞根系并形成泡囊、菌丝、孢子和丛枝，说明根内根孢囊霉能与枸杞根系形成良好的共生关系。

图1 根内根孢囊霉在枸杞根系中的定殖状况Fig.1 Colonization of Rhizophagus intraradices in roots of Lycium barbarum

2.5 枸杞根系丛枝菌根侵染率

由图2可知：菌根真菌对枸杞根系的侵染率随接种时间增加呈现先升高后降低的趋势，且RI和RI+FS处理组之间差异显著(P<0.05)。30 d时，RI和RI+FS处理的侵染率分别为10.80%和8.95%；60 d时，RI和RI+FS处理的侵染率分别为15.33%和13.89%；90 d时，侵染率达最大值，RI和RI+FS处理分别为45.61%和40.42%；120 d时侵染率降低，RI和RI+FS处理分别为43.73%和38.71%。CK组未检测到侵染。

图2 不同生长阶段枸杞根系菌根侵染率Fig.2 Mycorrhizal infection rate of L.barbarum root at different growth stages

2.6 接种根内根孢囊霉对枸杞相关防御酶活性的影响

由图3可知：RI处理可提高枸杞植株防御酶(PPO、POD、SOD、PAL、APX和CAT)的活性。相较于CK，接种90 d后RI处理的PPO、POD、SOD、PAL、APX和CAT活性分别增加66.21%、67.36%、36.28%、24.25%、47.13%和66.05%；FS处理的枸杞植株PPO、POD、SOD、APX和CAT活性相较于CK也有不同程度的上升，但差异不显著(P>0.05)；RI+FS处理后，枸杞植株叶片防御酶(PPO、SOD、PAL、APX和CAT)活性分别比FS处理显著增加60.81%、51.72%、88.31%、57.54%和48.13% (P<0.05)。说明根内根孢囊霉与植株根系建立共生关系的过程中能激活枸杞抗氧化酶保护系统，从而提高根腐病抗性。

图3 不同接种处理对枸杞抗病相关防御酶活性的影响Fig.3 Effects of different inoculation treatments on the activities of disease-resistance related defense enzymes of L.Barbarum

3 讨论

刘润进等[19]研究发现：AM真菌可促进植物营养元素和水分吸收，使植株生长更旺盛，有助于植株抗病性的提高，其作为生防菌调控植物病害的生理机制具有重要作用。AM真菌通过发达的根外菌丝网络扩大根系吸收范围，提升宿主植物对土壤养分的吸收与利用能力[20]，与非菌根化植株相比，高营养水平的菌根化植株会表现出更强的抵御病原菌侵染能力。植物受到病原菌侵害造成的生物量损失和功能损伤可通过与AM真菌建立的共生体得到补偿[21-22]。本研究通过盆栽试验发现：在自然条件下，接种AM真菌能够侵染枸杞植株根系，形成菌根共生体。在接种根内根孢囊霉 90 d时侵染率达到峰值，在120 d时侵染率呈下降趋势，其原因可能是病原菌的致病性所致，但是否还存在其他因素的影响有待进一步研究。此外，本研究还探明了AM真菌对枸杞生长和根腐病病原物的抑制作用、相关生理变化及AM真菌—宿主植物—病原物之间的组合效应。本研究表明：接种根内根孢囊霉叶绿素含量均高于其他处理且发病率和病情指数同对照相当，维持在较低水平。与CK相比，RI处理下株高增加54.86%，茎粗增加35.94%，鲜质量增加126.91%，干质量增加148.18%，这与前人在景天三七(Sedum aizoon)[23]上研究的结果类似。该结果表明：在病原菌胁迫下，菌根化枸杞的生物量和叶绿素含量均有不同幅度的增加。接种根内根孢囊霉可促进植株根系发育和营养元素吸收，减轻病原菌对根系造成的伤害，间接增强枸杞的抗根腐病能力。

AM真菌与植物根系建立共生关系的过程中能诱导植物启动防御反应[24]，病原菌侵染植物时AM真菌能及时诱发一系列生理生化变化以增强植物多套防御体系，提高植物系统抗性。有研究发现：接种摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)可显著提高链孢霉(Neurosporacrasasp.)侵染的紫苏根系CAT、POD和SOD活性，减轻病原菌对植物根系造成的损害，提高植物根系对病原菌的抵抗能力[25]。已有研究表明：接种根内根孢囊霉可显著提高芦笋根系SOD和APX活性，增强植株对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抗性[26-28]。本研究也发现：RI+FS处理下枸杞植株防御酶(PPO、SOD、PAL、APX和CAT)活性均显著高于FS处理 (P<0.05)。出现这种情况的原因一方面可能是根内根孢囊霉与植株根系建立共生关系的过程中能激活枸杞抗氧化酶保护系统，从而提高根腐病抗性；另一方面可能是根内根孢囊霉侵染枸杞根系，使根系皮层细胞壁变厚以构筑抵抗病原菌侵入形成机械保护屏障，激活植株防御体系，调节根系分泌物，并维持较高的酶活性从而提高宿主植株抗病性。通过本研究可以初步确定接种根内根孢囊霉对枸杞生长和抗根腐病过程具有重要作用，但在基因水平上是如何调控防御酶活性的表达进而增强植物抗病性还有待进一步研究。今后应加强枸杞病害相关酶、物质代谢和调控信号传导途径诱导根腐病系统抗性的作用及调控基因表达的研究，从分子机理进一步阐释AM真菌调控植物病害的应答效应。