过敏性紫癜患儿外周血miR-223 NLRP3表达及临床意义

黄丽芳 刘景珍 徐江维 饶 媚 谢 根

过敏性紫癜(henoch-schonlein purpura，HSP)也称为免疫球蛋白A(immanoglobulin A,IgA)血管炎[1]，是一种IgA介导的疾病，该病在2～6岁的儿童中最常见，最显著的特征是紫色皮疹，通常出现在小腿和臀部，还可引起腹痛和关节疼痛[2]。如不能及时诊断并治疗可出现持续性紫癜或关节炎及进行性肾损伤等[3]。目前HSP的确切病因尚不清楚，因此了解HSP的相关重要因素进行早期诊断、加强防治，对临床工作具有重要意义。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是一种炎性相关因子，可以诱导NLRP3炎性小体的形成，NLRP3炎症小体不仅在先天免疫中起关键效应器的作用，还会引发炎症疾病中相关促炎细胞因子的产生[4]。miR-223首次在造血系统中被识别，在骨髓体系中特异性表达，目前认为其在多种炎症疾病中发挥作用。有研究[5]表明，NLRP3的表达可被miR-223调控，但二者在HSP患儿中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在通过检测HSP患儿外周血中NLRP3、miR-223的水平变化，探讨二者在HSP中的关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年7月至2020年5月在恩施土家族苗族自治州中心医院就诊并确诊为HSP的患儿60例，其中男性患儿28例，女性患儿32例，年龄5～10岁，平均(8.60±3.50)岁。选取60例同期来本院体检的健康儿童为对照组，其中男性患儿30例，女性患儿30例，年龄5～12岁，平均(8.65±2.70)岁。HSP组和对照组的性别、年龄比较，差异无统计学意义(χ2=0.133，t=0.088，P>0.05)，具有可比性。HSP组纳入标准：①所有患儿符合诸福棠主编第8版《实用儿科学》[6]中小儿HSP诊断标准；②首次发病；③入院前未使用激素、免疫抑制剂等相关药物治疗。排除标准：①患有红斑狼疮或其他自身免疫性疾病者；②有凝血功能障碍者；③临床资料不完整。本研究所有样品采集均取得受试者知情同意，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器 实时荧光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：MA-5000，苏州雅睿生物技术股份有限公司)；全自动高速分析分选流式细胞仪(货号：DLK0002866，美国BD公司)；全自动生化分析仪(型号：CH930，上海聚慕医疗器械有限公司)；RNA提取试剂盒(货号：YT9197，北京伊塔生物科技有限公司)；反转录试剂盒(货号：YT9036，北京伊塔生物科技有限公司)；AceQ qPCR SYBR©Green Mix(货号：Q511-02/03，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；miScript SYBR© Green qPCR Kit(货号：QP071，美国GeneCopoeia)；人NLRP3 酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(货号：EH4202，武汉菲恩生物科技有限公司)。

1.2.2 标本采集 两组研究对象均空腹采集外周血5 mL，放至室温静置15 min后，一部分将其放入离心机，采用3 000 r/min离心处理30 min，取上层血清置于-80℃保存备用。另一部分采用Ficoll分离液分离外周血单个核细胞，用于流式细胞术检测。

1.2.3 ELISA法检测外周血中NLRP3测定 采用ELISA法检测各组外周血中NLRP3的表达水平，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 qRT-PCR法检测外周血中miR-223水平 取上层血清标本200 μL，Tizol法提取总RNA，再取1 μg总RNA作为模板进行反转录，获得cDNA。反应体系为：正、反向引物各1 μL，无RNA酶的灭菌水3 μL，Mix 10 μL，50 ng/μL的cDNA模板1 μL。反应步骤：95℃下预变性3 min，然后95℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s的条件进行，共设40个循环，所有条件均按照检测系统严格进行。采用2-ΔΔCT法对血清miR-223表达水平进行定量分析。miR-223及内参U6的引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 观察指标 采用免疫比浊法检测外周血中IgA、IgG、IgM免疫球蛋白水平；采用流式细胞仪对T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+进行检测，并计算CD4+/CD8+。检测并比较两组对象外周血免疫球蛋白和T细胞亚群水平差异。

2 结果

2.1 两组研究对象免疫学指标水平比较 HSP组与对照组CD3+表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。HSP组患儿外周血中IgA、IgG、IgM、CD8+水平均高于对照组，CD4+、CD4+/CD8+水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组研究对象一般资料及免疫学指标水平比较

2.2 两组研究对象外周血中NLRP3和miR-223水平比较 HSP组NLRP3表达水平低于对照组， miR-223水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组研究对象外周血中NLRP3、miR-223表达水平

2.3 NLRP3和miR-223表达与免疫功能指标的相关性分析 NLRP3和miR-223分别与IgA、IgG、IgM、CD8+、CD4+、CD4+/CD8+进行相关性分析，结果表明，外周血NLRP3与IgA、IgG、IgM、CD8+均呈正相关(P<0.05)，与CD4+、CD4+/CD8+呈负相关(P<0.05)；miR-223与CD4+、CD4+/CD8+均呈正相关(P<0.05)，与IgA、IgG、IgM、CD8+呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 HSP组NLRP3和miR-223表达水平与免疫功能指标的相关性

2.4 HSP患儿外周血中NLRP3、miR-223表达的相关性 Pearson法分析结果显示，HSP患儿外周血中NLRP3、miR-223表达呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.340，P<0.05)，见图1。

图1 HSP患儿外周血中NLRP3、miR-223表达相关性分析

2.5 外周血中NLRP3、miR-223水平对HSP发生的诊断价值 ROC曲线分析显示，外周血miR-223、NLRP3水平预测HSP患儿的AUC分别为0.974(95%CI：0.928～0.995)、0.956(95%CI：0.902～0.985)，对应的敏感度分别为98.33%、83.33%，特异度分别为88.33%、96.67%，外周血miR-223、NLRP3水平联合预测HSP患儿的AUC为0.987(95%CI：0.947～0.999)，敏感度为98.33%，特异度为90.00%。见图2。

图2 NLRP3、miR-223单独及联合诊断HSP疾病的ROC曲线

3 讨论

HSP是儿童时期最常见的全身性血管炎，它的特点是在小血管中存在IgA为主的免疫沉积物[7-8]。这些免疫沉积物可以激活中性粒细胞并增加炎性细胞因子的产生，从而引起皮肤、肠道和肾脏的变化[9]。HSP的发病诱因涉及免疫紊乱、感染以及药物反应等多个方面，该病早期实验室检查对HSP的诊断特异性较低，对症状不明显的患儿容易出现漏诊、误诊[10]，严重威胁患儿的生命安全。

miRNA是长度约为21～25 nt的内源性非编码RNA小分子。据报道[11]，miRNA在多种自身免疫性疾病中表达失调，在维持免疫稳态中起着至关重要的作用。miR-223定位于Xq12，参与造血系统分化过程，研究[12]表明，miR-223与机体免疫反应、造血功能等过程密切相关，参与了多种疾病发展进程，包括癌症、炎症以及自身免疫性疾病等。本研究中HSP患儿外周血中miR-223水平明显低于对照组，HSP患儿的免疫功能指标IgA、IgG、IgM、CD8+表达水平均高于健康儿童，CD4+、CD4+/CD8+表达均低于健康儿童，miR-223与IgA、IgG、IgM、CD8+呈负相关，与CD4+、CD4+/CD8+呈正相关，提示HSP患儿体内免疫功能发生紊乱，miR-223表达降低与HSP的发生发展相关。ROC结果显示，miR-223水平预测HSP的AUC为0.974，对应的敏感度为98.33%，特异度为88.33%，表明miR-223可能参与HSP疾病的发生，且可在一定程度上评估HSP的发生。

NLRP3是体内固有免疫的重要组分，由细胞内多种蛋白复合物组成，在炎症反应中有重要作用[13-15]。谭之能等[16]研究的表明，NLRP3在慢性阻塞性肺病患者外周血中的水平升高，其水平变化与疾病严重程度密切相关。王瑾等[17]报道了miR-223可靶向作用NLRP3，减轻大鼠肾脏损伤。本研究中HSP患儿外周血中NLRP3表达水平明显高于对照组，外周血NLRP3水平与IgA、IgG、IgM、CD8+呈正相关，与CD4+、CD4+/CD8+、miR-223表达水平呈负相关，与既往研究文献报道一致，提示NLRP3可能通过调控miR-223参与HSP的病理过程。ROC结果显示，NLRP3水平预测HSP的AUC为0.956，对应的敏感度为83.33%，特异度为96.67%， miR-223、NLRP3二者联合预测HSP患儿的AUC为0.987(95%CI：0.947～0.999)，敏感度为98.33%，特异度为90.00%，二者联合联测高于单一指标。推测二者在HSP病情进展中的可能作用为：miR-223在病理作用下表达水平降低，减弱了NLRP3炎性体的抑制作用，并使其表达水平升高，二者之间存在某种负反馈机制，与以往研究结果相符合[18-19]。而NLRP3是免疫应答的重要组成部分，其异常高表达会诱导多种炎性因子分泌，尤其是IgA的升高，进而引起小血管炎症，导致皮肤、肠道和肾脏的变化，最终发生HSP。

综上所述，NLRP3在HSP患儿外周血中高表达，miR-223低表达，二者呈显著负相关，参与儿童HSP的发生，还可作为HSP疾病的早期诊断指标，具有重要的临床意义。但NLRP3、miR-223在HSP的发生的机制有待进一步研究，需要进一步扩大样本量。