TIAM1、GRIM19在I型子宫内膜癌中的临床意义及预后影响*

尹满群,黄守国,张 静,符建桃

(中南大学湘雅医学院附属海口医院，海口 570000)

子宫内膜癌(endometrical carcinoma，EC)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤。近年来，子宫内膜癌的发病年龄逐步年轻化，发病人数也明显增多。尽管子宫内膜癌的诊断和传统治疗的进展都在加快，但子宫内膜癌发生的生物学和分子机制研究相对匮乏。因此，识别新的生物标志物和探索治疗靶点可能对子宫内膜癌患者的个体化治疗策略有一定的指导意义。近年来关于T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(tlymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，TIAM1)与干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因19(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19,GRIM19)和多种实体肿瘤的关系也日益得到证实。TIAM1可增强细胞迁移、黏附与侵入，促进细胞骨架重组、改变细胞形态等，还可参与蛋白质相互作用，以及抑制转录因子c-myc表达,从而影响细胞增殖、凋亡、黏附与迁移,发挥促癌作用[1-2]。GRIM19主要通过与STAT3发生特异性相互作用，从而抑制其转录激活活性和靶基因表达,干扰STST3激活的下游抗凋亡通路中各个基因的表达，如Bcl-2、Bcl-xl、cyclin、c-myc、c-Jun，还可参与线粒体氧化呼吸过程,从而影响细胞的生长和增殖[3]。多项研究证实，TIAM1和GRIM19在多种妇科恶性肿瘤及腺癌中均有特异表达，并与肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移关系密切，有望成为监测肿瘤疾病进展及预后评估的生物标志物。但TIAM1和GRIM19与I型子宫内膜癌的关系尚不明确。本研究采用免疫组化检测TIAM1、GRIM19在I型子宫内膜癌中的表达进而分析其临床意义及预后影响，以期为I型子宫内膜癌的诊治提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2014年6月至2018年6月在海口市人民医院行手术切除治疗且术后病理结果明确为Ⅰ型子宫内膜癌患者70例，年龄32～77岁(54.2±9.69)岁。患者均行全子宫切除术+双侧附件切除术+盆腔淋巴结清扫术。选取同期子宫内膜不典型增生组24例，年龄35～65岁(50.10±5.23)岁；子宫内膜增生不伴不典型增生组20例，年龄36～59岁(49.5±6.85)岁，正常子宫内膜组(因子宫肌瘤行全子宫切除术且排除内膜病变)28例，年龄45～69岁(52.4±4.58)岁。4组患者的年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。纳入对象临床资料完整，不合并其他系统肿瘤，术前未行任何放化疗、生物治疗等抗肿瘤治疗。子宫内膜癌患者中，<50岁23例,≥50岁47例；高分化18例,中、低分化52例；手术病理分期:早期病变(Ⅰ期46例和Ⅱ期6例)52例,晚期病变(Ⅲ期和Ⅳ期)18例；<1/2肌层浸润深度38例，≥1/2肌层浸润深度32例;淋巴结转移者16例，无淋巴结转移者54例。所有存档蜡块均重新做常规HE染色且由2名副高病理医生复查筛选后入组。

1.2 随访 截至2021年6月，通过电话或门诊对子宫内膜癌患者进行随访，以影像学检查发现复发、转移癌灶为无瘤生存终点，随访率100%，随访时间3～82个月，中位随访时间58个月。

1.3 方法

1.3.1 主要试剂 兔单克隆抗体TIAM1购自ABclonal公司,兔单克隆抗体[EPR14515(2)]GRIM19购自Abcam公司，SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新，图像采集采用显微镜及多功能图像分析工作站(OLYMPUS，CX21，日本)。

1.3.2 免疫组化检测TIAM1、GRIM19蛋白表达 将组织蜡块进行石蜡切片，厚约4μm。经常规脱蜡、脱水，EDTA液与蒸馏水的比例为1∶50加压修复，PBS冲洗3遍，滴加TIAM1及GRIM19一抗，37℃暖箱孵育1h，再用PBS冲洗3遍，滴加二抗15min，PBS冲洗3遍，DAB工作液显色5min，水洗，苏木素染色，水洗，分化1s，水洗，返蓝，流水冲洗，脱水，吹干，封片。阴性对照为未加一抗的PBS缓冲液，阳性对照为正常子宫内膜组织、子宫内膜非不典型增生组织、子宫内膜不典型增生组织，每批染色均设置阴性和阳性对照。随机选取10个高倍视野，每个高倍视野观察100个细胞，计数着色细胞数及着色程度，着色细胞数计分分为5个等级：≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%，分别计为0、1、2、3、4分；着色强度计分:无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色，分别计为0、1、2、3分。两种分值相乘，0分为阴性(-),1～3分为弱阳性(+),4～8分为中等阳性(++),9～12分为强阳性(+++)。按免疫组化结果分为两组，总积分0～4分为低表达，≥5分为高表达。所有切片均由2名病理科副高职称医生采用双盲法单独阅片，取两人计分平均值。

2 结 果

2.1 子宫内膜组织中TIAM1和GRIM19表达水平比较 TIAM1蛋白在正常子宫内膜中呈低表达，在子宫内膜癌组织中呈高表达且主要定位在细胞内(膜、浆)，阳性细胞表现为棕黄色或棕褐色颗粒弥漫性分布。见图1。TIAM1在正常子宫内膜组、子宫内膜增生不伴不典型增生组、子宫内膜不典型增生组、Ⅰ型子宫内膜癌组中高表达率分别为28.57%(8/28)，45.00%(7/20)，62.50%(15/24)，70.00%(49/70)，差异有统计学意义(P<0.05)；子宫内膜癌高于正常组和增生不伴不典型增生组，不典型增生组高于正常组，差异有统计学意义(P均<0.05)；而Ⅰ型子宫内膜癌组与子宫内膜不典型增生组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、2。

表1 子宫内膜组织中TIAM1及GRIM19蛋白表达水平

表2 子宫内膜组织中TIAM1、GRIM19表达阳性率比较[n(%)]

GRIM19在正常子宫内膜中呈高表达，在子宫内膜癌组织中呈低表达且主要定位于细胞质，表现为棕黄色颗粒弥漫分布。见图1。GRIM19在正常子宫内膜组、子宫内膜增生不伴不典型增生组、子宫内膜不典型增生组、I型子宫内膜癌组中高表达率分别为96.43%(27/28)，80.00%(16/20)，62.50%(15/24)，45.70%(32/70)，差异有统计学意义(P<0.05)；子宫内膜癌组GRIM19高表达率低于正常组和增生不伴不典型增生组，不典型增生组低于正常组(P均<0.05)；而I型子宫内膜癌组与子宫内膜不典型增生组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、2。

图1 免疫组化检测TIAM1、GRIM19蛋白表达(×100)

2.2 子宫内膜癌组织中TIAM1及GRIM19蛋白表达相关性 子宫内膜癌组织中TIAM1及GRIM19蛋白表达明显相关(r=-0.373，P<0.05)。见表3。

表3 子宫内膜癌组织中TIAM1及GRIM19蛋白表达相关性

2.3 子宫内膜癌组织中TIAM1和GRIM19表达与病理参数的关系 子宫内膜癌组织中TIAM1蛋白表达与分化程度、肌层浸润、有无淋巴结转移有关(P<0.05)，而与年龄、手术病理分期、脉管转移、绝经、合并高血压、合并输卵管堵塞无明显相关(P>0.05)。GRIM19蛋白表达与分化程度、手术病理分期、肌层浸润深度、有无淋巴结转移、是否合并高血压组、是否发生脉管转移有关(P<0.05),而与年龄、有无合并输卵管堵塞、是否绝经、产次无明显相关(P>0.05)。见表4。

表4 研究组患者子宫内膜腺癌组织中TIAM1、GRIM19表达与临床病理参数

2.4 子宫内膜癌患者生存率的单因素分析 随访子宫内膜癌患者术后近3年生存情况，其中存活57例，死亡13例，3年存活率81.43%。患者的生存率与手术病理分期、肌层浸润、有无淋巴结转移、有无脉管浸润及GRIM19表达水平有关(P<0.05)，而与年龄、分化程度、是否绝经、是否合并高血压、TIAM1表达无明显相关性(P>0.05),见表5。

表5 影响研究组子宫内膜癌患者生存率因素

2.4.1 Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验 子宫内膜癌患者中GRIM19蛋白高表达者的总生存期和无瘤生存期均明显高于GRIM19蛋白低表达者。GRIM19蛋白高表达和低表达组的总生存期分别为(90.665±2.291)月、(67.706±3.668)月,无瘤生存期分别为(89.688±2.954)月、(62.342±5.016)月。Log-rank检验结果显示,两组差异有统计学意义(Log-rank分别为6.682和6.251,P分别为0.010和0.012),见图2A、B。

图2 Kaplan-Meier生存曲线

2.4.2 术后辅助放化疗与I型子宫内膜癌患者的Kaplan-Meier生存曲线 子宫内膜癌患者中未放疗组和放疗组的总生存期分别为(59.541±6.650)月、(78.611±2.779)月,无瘤生存期分别为(50.667±8.995)月、(76.073±3.756)月。Log-rank检验结果显示，两组差异有统计学意义(Log-rank分别为6.501和7.473，P分别为0.011和0.006)，见图2C、D。子宫内膜癌患者中未化疗组和化疗组的总生存期分别为(63.568±7.751)月、(83.301±2.795)月,无瘤生存期分别为(54.625±9.927)月、(80.825±3.844)月。Log-rank检验结果显示,两组差异有统计学意义(Log-rank分别为9.936和9.956，P分别为0.002和0.002)，见图2E、F。

3 讨 论

TIAM1定位于21q22.11，含1591个氨基酸残基，分子量为177kD[4]。多项研究表明,TIAM1在癌症中充当启动子的角色，TIAM1在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌组织中的表达水平逐渐升高，并与分化程度、肌层浸润深度、淋巴结转移呈正相关,TIAM1上调可促进癌症进展，常预示生存结局不良[5]。TIAM1在卵巢癌组织中呈高表达，明显高于正常卵巢组织及卵巢良性肿瘤，TIAM1高表达与卵巢癌的高组织学分级、临床分期晚、转移和低生存期发生率密切相关，TIAM1高表达者的总生存期和无瘤生存期均明显低于TIAM1低表达者；此外，miR-1271-5p可直接抑制TIAM1使Notch信号通路失活，从而抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移，可见miR-1271-5p/TIAM1可能成为一个新型卵巢癌治疗方案[6-8]。TIAM1在肺癌组织中呈高表达，并与组织类型、临床分期、淋巴结转移密切相关,TIAM1缺失降低了肺癌细胞的生存能力和致瘤性，还可作为肺腺癌的独立预后因素，TIAM1高表达常预示肺癌患者较差的生存结局[9-11]。研究还发现，TIAM1在肝癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌等原发肿瘤及其转移瘤组织中呈高表达，并与恶性实体瘤患者较短的生存期和多种临床病理参数显著相关,TIAM1上调还可通过FGFR/STAT3通路使乳腺癌细胞对NVP-BEZ235产生耐药性，表明TIAM1可能是一种有前景的预后生物标志物和恶性实体肿瘤的有效治疗靶点[12-17]。GRIM19定位于19p13.2,由144个氨基酸残基构成，分子量约16kDa[18]。研究证实，GRIM19在多种恶性肿瘤中呈低表达并影响肿瘤发展，GRIM19在胃、结直肠癌组织中呈低表达，并与分化程度和临床分期密切相关，GRIM19下调可加速胃、结直肠癌转移；体外和体内实验发现，GRIM19可抑制结直肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，还能增强奥沙利铂治疗结直肠癌的效果。因此，GRIM19是临床治疗胃癌和结直肠癌潜在的生物标志物和治疗靶点[19-21]。Western blot与免疫组化结果显示，GRIM19在卵巢癌中表达最低，其次是卵巢交界性肿瘤和卵巢良性肿瘤，而在正常卵巢中表达量高;卵巢上皮癌中GRIM19表达水平与FIGO分期呈负相关，淋巴转移灶中GRIM19和STAT3表达与原发灶呈显著正相关[22]。此外，GRIM19蛋白和mRNA水平在肾透明细胞癌组织中下调，并与TNM分期、Fuhrman分级和淋巴结转移呈负相关，这表明GRIM19作为一种肿瘤抑制因子，其缺失促进了肾透明细胞癌的发展和进展[23]。GRIM19在子宫腺肌症、多发性硬化症中也发挥着重要的作用[24-25]。

本研究发现，TIAM1在正常子宫内膜、子宫内膜增生不伴不典型增生、不典型增生、子宫内膜癌中呈递增趋势，且子宫内膜癌组织中TIAM1表达水平显著高于正常组和增生不伴不典型增生组，不典型增生组显著高于正常组，GRIM19则相反；随着分化程度越差、肌层浸润越深，TIAM1表达水平越高，TIAM1表达还与淋巴结转移关系密切。这表明TIAM1蛋白在子宫内膜癌的形成与演变过程扮演驱动基因的角色，参与子宫内膜病变的恶性转化、侵袭和转移过程。GRIM19表达与I型子宫内膜癌的分化程度、手术病理分级、肌层浸润深度、淋巴结转移、脉管转移呈负相关。同时生存分析结果显示，GRIM19高表达患者的生存率显著高于低表达患者。推测低表达的GRIM19可能失去了抑癌作用而促进细胞恶变和转移，这与以往报道在其他恶性肿瘤中的研究结论一致[18-25]。本研究发现，手术病理分期Ⅲ～Ⅳ级、深肌层浸润者、有淋巴结转移者、有脉管浸润的生存率分别显著低于Ⅰ～Ⅱ级、浅肌层浸润者、无淋巴结转移者和无脉管转移者；GRIM19蛋白低表达患者的总生存时间和无瘤生存时间明显少于高表达患者，提示GRIM19低表达可成为子宫内膜癌患者不良预后的重要分子指标，GRIM19可能成为子宫内膜癌临床诊疗的潜在治疗靶点。因此，监测TIAM1和GRIM19表达水平有望成为监测子宫内膜癌疾病进展、疗效评估与预后监测的一个重要指标。

Ⅰ型子宫内膜癌中TIAM1呈高表达，GRIM19呈低表达，两者在Ⅰ型子宫内膜癌分化程度、肌层浸润深度、淋巴结转移等方面呈相反的作用，分别对Ⅰ型子宫内膜癌的发生发展起着促进或抑制的作用。TIAM1的促癌机制与GRIM19的抑癌机制有共同作用点，两者均可通过影响细胞供能,调节细胞增殖与凋亡。TIAM1有一个重要的DH功能区，是Rho样GFPase的GDP分离刺激因子(GDS)，具有鸟苷酸转换活性，通过GDP-GTP转换，促进GDP的释放以及与GTP的结合，调节Rho样GTP酶Rac1活性，刺激葡萄糖的摄取并调节肌动蛋白聚合、细胞黏附与迁移及细胞增殖凋亡等[1-2]。GRIM19在线粒体I型呼吸过程中至关重要，参与了细胞的供能和凋亡的启动[3]。两者促癌机制还与c-myc密切相关，TIAM1抑制c-myc诱导的转录和细胞凋亡,GRIM19启动JAK-STAT信号传导通路改变c-myc转录表达，影响细胞增殖和凋亡[2-3]。c-myc是一种参与细胞增殖、凋亡以及侵袭转移过程的转录因子蛋白[26]，在子宫内膜癌患者的血清和肿瘤组织中均有高表达，并与手术病理分期、浸润深度、淋巴结或远端转移密切相关[27]。本实验通过Spearman等级相关性检验发现，70例Ⅰ型子宫内膜癌织中，TIAM1及GRIM19同时高表达16例，同时低表达5例，TIAM1及GRIM19蛋白表达呈负性相关。这提示在Ⅰ型子宫内膜癌中，TIAM1蛋白与GRIM19蛋白可能是通过某些作用机制相互联系，是否以上述通路发挥拮抗作用共同影响子宫内膜癌的恶性进展过程，仍需进一步证实。

本研究显示，术后辅助放疗患者的总生存时间和无瘤生存时间明显高于未放疗组，术后辅助化疗患者的总生存时间和无瘤生存时间明显高于未化疗组。这表明术后辅助放化疗可在一定程度上延长生存时间。

本研究首次探讨TIAM1和GRIM19在Ⅰ型子宫内膜癌肿瘤进展中的生物学意义，不仅为肿瘤的致癌作用提供了新的视角，也为通过靶向治疗Ⅰ型子宫内膜癌提供了新的策略。实验再次证实术后放化疗在一定程度上可有效降低子宫内膜腺癌的复发率。因此，术前癌基因检测、联合靶向治疗和术后放化疗将在一定程度上为攻克子宫内膜癌难题提供更好的解决方案。但本研究仅基于蛋白表达层面上探讨TIAM1和GRIM19与子宫内膜癌的相互关系，其具体作用机制尚不清楚。此外，本实验样本量相对小、检验方法单一，后续研究需加大样本量以及增加论证方法进一步论证或深入到基因层面上探讨TIAM1和GRIM19基因在I型子宫内膜癌组织中的发病机制。