酶联免疫吸附法和实时荧光定量PCR法检验EB病毒的效果比较

张缤月

(吉林省一汽总医院 检验科,吉林 长春130011)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)为具传染性单核细胞增多症病原体，与鼻咽癌、儿童淋巴瘤发生发展密切相关[1]。该病主要通过唾液传播，一般发生于幼儿，经口咽上皮细胞增殖后，引发B淋巴细胞感染，后进入血液循环引发全身性感染，急性期主要表现为咽炎、发热、淋巴结炎等上呼吸道感染症状，急性期后会持续发生低热、疲劳等症状，尤其免疫缺陷者感染EB病毒后死亡风险较高，因此需尽早鉴别诊断，并实施针对性治疗，以快速改善患者临床症状，保障其生命安全[2-3]。实施荧光定量PCR为该病主要诊断办法，诊断准确度高，属临床诊断金标准，但此种诊断方案对仪器设备要求较高、诊断用时较长，影响临床诊断需求[4]。酶联免疫吸附法(ELISA)，指利用酶法标记抗原或抗体，以检测相应抗原或抗体的免疫学标记技术，具灵敏性强、特异性高、重复性好等特点，同时可满足临床快速、大量检出特性，但在EB病毒检验中，此种检验方法是否与实施荧光定量PCR具相同诊断价值研究较少[5]。为此，本次研究选吉林省一汽总医院2020年1月至2021年8月期间110例上呼吸道感染患者为研究对象，均应用上述两种方案检验，分析两种检验结果差异性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选吉林省一汽总医院2020年1月至2021年8月期间110例儿科上呼吸道感染患者为研究对象，其中男性57例、女性53例，年龄16 d-12岁，平均(4.97±1.12)岁。

1.2 主要试剂

①人血DNA提取试剂盒(购自Omega公司)；②人外周血淋巴细胞分离液(购自中国天津灏阳)；③ELISA试剂盒中，EB病毒壳抗原(VCA)IgG检测试剂盒、EB-VCA-IgM抗体试剂盒、EB病毒早期抗原(EA)IgG试剂盒、EB病毒核抗原(NA1)IgG抗体检验试剂盒均购自北京贝尔。

1.3 方法

1.3.1实时荧光定量PCR检验 ①样本准备：采集患者2 ml血液样本，装于枸橼酸抗凝试管中，-4℃储存备用；取1 ml抗凝血，加1 ml无菌生理盐水，混匀后，加1 ml人外周血淋巴细胞分离液，水平离心，700 g离心20 min；取单个细胞层，转移至无菌室管中，17 000 g离心10 min，弃上清，留沉淀，加50 μl DNA提取液，混匀，恒温处理(100℃，10 min)，复温后1 700 g离心5 min，取上清(模板)备用；(2)实施荧光定量PCR扩增：取2 μl上清液，加入PCR反应缓冲液，准备PCR扩增；实时荧光定量PCR检测EBNA1、BZLF1水平，扩增反应体系：2×SYBR Green Master Mix 5 μl，EBNA1、BZLF1基因上下游引物及逆转录产物分别为0.5 μl、2.5 μl，ddH2O 1.5 μl；反应条件：预变性(95℃，2 min)、变性(95℃，2 min)、退火(60℃，15 s)、延伸(72℃，30 s)，共进行40个循环，引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.3.2ELISA法检验 采集患者2 ml静脉血加至促凝管中，静止沉淀30 min，分离血清。严格依据试剂盒说明书要求操作，进行EB抗体、抗原检验，并设置阳性、阴性、临界对照实施室内质量控制。

1.4 观察指标

(1) 统计比较实时荧光定量PCR及ELISA法的EB病毒阳性检出率[6]：①实时荧光定量PCT阳性标准：Ct值在13-35之间，出现S型曲线，且溶解曲线为单一峰值，即为阳性，否则则为阴性；②实时荧光定量PCR对EB病毒分期检出情况：病毒活动性感染：EBNA1、BZLF1均为阳性；潜伏期感染：EBNA1阳性，BZLF1阴性；未感染：EBNA1、BZLF1均为阴性；②ELISA[7]：经试剂盒检验后，计算待测样本A值与临界指控物A比值；阳性：比值>1.1；阴性：比值<0.8；可疑弱阳性：0.8≤比值≤1.1；若为弱阳性，则在2周后重新采集样本检验。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR检验中EB病毒阳性检出率情况

经荧光定量PCR检验中，EBV-DNA阳性检出率为50.91%(56/110)，其中EB病毒活动性感染占比为20.00%(22/110)、潜伏期感染占比为30.91%(34/110)。

2.2 EB病毒活动性感染中ELISA检验结果

22例EBV-DBA阳性患者中，经ELISA检验，EB-VCA-IgM阳性率为95.45%(21/22)、100.00%(22/22)，与EBV-DNA阳性检出率相近(P>0.05)；EB-NA1-IgG、EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG阳性检出率分别为68.18%(15/22)、77.27%(17/22)、72.73%(16/22)，较EBV-DNA阳性检出率低(P<0.05)，见表2。

表2 EB病毒活动性感染中ELISA检验结果[n(%)]

2.3 EB病毒潜伏期感染中ELISA检验结果

34例潜伏期感染患者中，经ELISA检验，EB-NA1-IgG阳性率分别为94.12%(32/34)，与EBV-DNA潜伏期感染检出率相近(P>0.05)；EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG、EB-VCA-IgM阳性检出率为82.35%(28/34)、88.24%(30/34)、82.35%(28/34)，较EBV-DNA潜伏期检出率低(P<0.05)，见表3。

表3 EB病毒潜伏期感染中ELISA检验结果[n(%)]

3 讨论

EB病毒属疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属，基因组成为DNA。人类为EB病毒感染宿主，无症状感染多发生于幼儿[8]。EBV致病机制多样化，在感染人体后，主要以两种形式存在，即病毒活动性感染期、潜伏感染期。病毒活动性感染期时，病毒以线性分子形式插入宿主细胞DNA中，通过复制、转录、翻译过程，完成病毒颗粒装配，并在病毒干扰下引发细胞裂解，引发相关临床症状。潜伏感染期以换装分子游离于细胞DNA外，持续性存在于细胞中，并随细胞正常分裂，不释放病毒颗粒，因此不会表现出明显临床症状。当潜伏感染期病毒经外界或内在因素刺激后，如其它病原菌感染、免疫机能下降、上皮组织损伤等情况时，潜伏感染期病毒基因组会被激活，诱发增殖性感染期，诱发相关临床症状。而儿童多具免疫能力低下、易发生上呼吸道感染性疾病等特点，且一般尚未养成良好卫生习惯，因此其EB病毒感染风险相对较高[9]。

王烨[10]在对厦门市儿童EB病毒感染情况调查分析中发现，经实时荧光定量PCR诊断，EB病毒阳性率为71.79%，说明儿童EB感染率较高；此类患儿主要临床表现为急性扁桃体炎、肺炎、单核细胞增多症、中性粒细胞减少症、轻度贫血、电解质文宽等，主要临床表现为发热、淋巴结肿大、扁桃体肿大等症状，且病毒载量高，临床症状更严重。说明在儿童上呼吸道感染患儿中，EB病毒感染为常见病因。除上呼吸道感染症状外，炎症性肠病患者同样存在EB病毒感染情况，且症状严重患者EB病毒阳性检出率显著提升[11-12]。说明在呼吸道黏膜、消化道黏膜感染性疾病中，EB病毒感染占比较高。若患者已经存在呼吸系统疾病，则在发生EB病毒感染后，会引发病症急性加重[13]。张正玲[14]在对156例慢阻肺急性加重期患者研究中发现，EB病毒感染患者炎症反应更严重，且在其治疗中，抗感染治疗时间明显延长，并发症发生率显著增加，重症病房入住率显著增加，血气指标恢复速度更缓慢。相关研究表示[15]，在对鼻型结外自然杀伤(NK)/T细胞淋巴瘤患者治疗中，若存在EB病毒感染，该病客观缓解率显著下降，而接受抗EB病毒治疗后，客观缓解率显著上升，说明说明EB病毒感染不仅会引发呼吸系统感染性疾病，同时会加重原有感染性疾病严重程度、加重患者淋巴结刺激，影响患者免疫功能，进而影响治疗效果，威胁患者生命安全，需尽早诊断评估，分析患者是否存在EB感染并实施抗EB病毒治疗，以改善预后。

目前在对EB病毒临床检验中，主要检验方案为实时荧光定量PCR技术检验。此种检验技术主要依靠病毒DNA水平实施检验，通过采集患者血液样本、唾液样本等，提取样本中病毒细胞DNA后，通过设计引物、扩增特定DNA片段等后，对特定片段进行荧光定量，以判定在检验中是否出现特定DNA片段，进而可实现基因水平临床诊断[16]。与传统定量PCR办法相比，实施荧光定量PCR技术有效解决了只能终点检测的局限性，可将每一轮循环中均进行荧光信号检测，将其记录在电脑软件中，并通过标准曲线获得定量结果。同时实施荧光定量PCR在样品Ct值计算中，Ct值重现性PCR循环在Ct值所在循环数时，刚刚进入指数扩增期，此时微小误差尚未方法，此时Ct值重现性极好，得到恒定Ct值，使检验结果更准确[17]。但在其临床检验中，因上呼吸道感染患者数量较多，且以儿童上呼吸道感染最为常见，因此在临床相关指标检验中，主要检验需求为检查结果准确度高、检出速度快，但实时荧光定量PCR诊断中，诊断用时相对较长，难以满足临床快速检出需求；且对诊断操作人员专业技术要求较高；同时应用此种检验办法临床检验中，对仪器设备要求较高，基层医疗机构难以实现此种检验方案检验，因此在临床诊断中，应用实时荧光定量PCR检验难以满足临床诊断需求。

ELISA检验中，主要原理为通过将抗体、抗原结合至某种固体相载表面，保持其免疫活性，并与相对应的抗原或抗体与特定酶相连，形成酶标抗体或酶标抗原，在保留酶抗体或抗原活性同时，保留了酶活性信号，在加入酶反应底物后，会经酶反应粗话为有色产物；而酶标抗原、酶标抗体量的多少，会出现不同程度颜色变化[18-19]。此种检验办法具诊断灵敏度高、特异性好、重复性好、检出速度快等特点，应用试剂盒即可快速、大量完成检验结果，为目前临床常用检验方案[20]。但在其临床诊断中，存在抗原、抗体可检测范围局限性影响，在诊断中，若抗原或抗体数量较少，则应用ELISA检验存在一定漏诊风险。

本次研究中，对EB病毒进行实时荧光定量PCR、ELISA两种方法检验，并进行两种检验方法检验结果比较分析，分析ELISA在对EB病毒检验中能够替代实时荧光定量PCR检验的可能性。在研究结果中显示，经荧光定量PCR检验中，EBV-DNA阳性检出率为50.91%(56/110)，其中EB病毒活动性感染占比为20.00%(22/110)、潜伏期感染占比为30.91%(34/110)，说明110例患儿上呼吸道感染静脉血中，确定EB病毒感染占比超过50%，说明在儿童上呼吸道感染中，EB病毒感染率较高。在对两种检验方案比较分析中发现，22例EBV-DBA阳性患者中，经ELISA检验，EB-VCA-IgM阳性率为95.45%(21/22)、100.00%(22/22)，与EBV-DNA阳性检出率相近(P>0.05)；EB-NA1-IgG、EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG阳性检出率分别为68.18%(15/22)、77.27%(17/22)、72.73%(16/22)，较EBV-DNA阳性检出率低(P<0.05)，考虑原因为，VCA-IgG、NA1-IgG、VCA-IgM、EA-IgG均为EB病毒常见ELISA检验项目，EBV壳抗原(VCA)抗体IgM在发病早期会迅速升高，但在感染数周后消失，为EBV急性感染期重要标志，一般在出现明显临床症状后，其血清水平会迅速上升，因此多用于感染后早期诊断[21-22]；在本次研究中，经实时荧光定量PCR检验中处于病毒活动性感染患儿，其EB-VCA-IgM阳性检出率较高，且阳性检出率与实时荧光定量PCR结果相近，说明在儿童急性上呼吸道感染致病菌中，存在EB病毒感染情况。正常情况下，EB-NA1-IgG阳性、EB-NA1-IgG阳性、EB-VCA-IgG阳性状态下，提示患者出现过远期感染情况，并非现行感染症状，在本次研究中，患儿EB-NA1-IgG、EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG阳性检出率均较实时荧光定量PCR低，提示部分患儿存在既往EB病毒感染情况。因此在临床诊断中，若出现上呼吸道感染症状，且经ELISA检查出现EB-VCA-IgM阳性检出率明显升高情况，提示患儿处于EB病毒活动性感染期，需在基础治疗上增加抗EB病毒治疗方案，包括提升患儿免疫力治疗等，以保证治疗效果[23]。同时也可以说明，在对上呼吸道感染患儿临床检验中，实时荧光定量PCR检查结果处于病毒活动性期时，EB-VCA-IgM表现出良好一致性，可用于临床诊断筛查。

本次研究结果显示，34例潜伏期感染患者中，经ELISA检验，EB-NA1-IgG阳性率分别为94.12%(32/34)，与EBV-DNA潜伏期感染检出率相近(P>0.05)；EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG、EB-VCA-IgM阳性检出率为82.35%(28/34)、88.24%(30/34)、82.35%(28/34)，较EBV-DNA潜伏期检出率低(P<0.05)，考虑原因为，正常情况下，若患儿经ELISE检验中EB-NA1-IgG为阳性，提示患儿存在远期EB病毒感染史，因此患儿血清中出现相应抗体，或说明患儿正处于EB病毒潜伏期；而处于EB病毒感染潜伏期状态下，易受免疫力下降、相关功能损伤而出现EB病毒被激活情况，因此在对呼吸道感染患儿临床诊断中，若出现EB-NA1-IgG阳性升高情况，需积极治疗原发病，并持续监控患儿EB病毒表达情况，避免EB病毒被激活影响治疗效果。而在研究结果中显示，EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG、EB-VCA-IgM阳性检出率较实时荧光定量PCR稍低，其中EB-VCA-IgM阳性率下降，可排除患儿处于EB病毒感染活动期，但EB-VCA-IgG、EB-EA-IgG阳性检出率下降，考虑原因可能与EB病毒感染史后患儿并未产生相应病毒抗体相关，或与实验室ELISA检查质量相关[24-25]。因此在对儿童上呼吸道感染EB病毒检验中，实时荧光定量PCR检验中患儿处于EB病毒感染潜伏期，则应用EB-VCA-IgG检验可获得相近检出效果，说明在临床检验中，可通过EB-VCA-IgM、EB-VCA-IgG水平评估患儿EB病毒感染状态。

综上，本次研究结果显示，在实时荧光定量PCR检验中，处于病毒活动期感染时，EB-VCA-IgM表现出良好诊断符合率；在处于EB病毒潜伏感染期时，EB-NA1-IgG表现出诊断一致性。但在诊断中仍存在一定漏诊率，因此必要时建议应用ELISA联合实时荧光定量PCR检验，以保证临床检验质量。