血栓通脉胶囊对血管内皮细胞和神经细胞氧化损伤和内质网应激作用机制的研究

赵佳囡，魏雪晨，丛 姝，邵 丹，宋 哲，唐 宏，马 杰，王 伟*

(1.吉林大学药学院，吉林 长春130021；2.通化市中西医结合医院)

血管壁损伤时，循环中的血小板被募集到损伤部位，组织因子使血液凝固，最终产生凝血酶和纤维蛋白，当病理过程超出止血的调节机制时，过量的凝血酶形成，引发血栓形成[1]。其中由于动脉内皮的损伤而形成的血栓，会导致冠状动脉和脑动脉阻塞，引起心绞痛、心肌梗死和脑梗死[2]。目前国内对于动脉血栓的治疗多采用西药为主并辅以中药的治疗方式，其中多以红花、桃仁、川芎、当归为主[3]，黄芪在治疗血栓方面已经有了一定的研究，大多集中在静脉血栓和肺部血栓栓塞方面[4,5]，对动脉血栓的疗效和机制研究报道还较少。本实验以黄芪为君药，辅以地龙、土鳖虫、水蛭、桃仁、川芎、橘红、当归、鸡血藤等药材，制备血栓通脉胶囊，并通过建构SD大鼠颈总动脉血栓模型及PC12、HUVEC细胞的氧化应激损伤模型，来探究血栓通脉胶囊对血管内皮细胞和神经细胞氧化损伤和内质网应激作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 雄性SD大鼠30只，8周龄，体重165-175 g，采购自北京华阜康生物科技股份有限公司。动物饲料、饮用水均进行消毒处理，室内温湿度恒定。

1.1.2实验细胞 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)采购自中国科学院昆明细胞库(编号：KCB93033YJ)；人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)采购自中国科学院昆明细胞库(编号：KCB2012087YJ)。

1.1.3药物与试剂 血栓通脉胶囊由通化市中西医结合医院提供。二磷酸腺苷(上海麦克林生化科技有限公司)；苏木素伊红染色试剂盒(北京索莱宝生物科技)；酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉elabscience)；高糖培养基(康宁公司)；小牛血清(美国Gibco公司)；3%过氧化氢(美国Sigma公司)；细胞增殖检测试剂盒(Promega公司)；乳酸脱氢酶、微量还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、丙二醛检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；活性氧检测试剂盒(碧云天生物技术)；ECL化学发光超敏显色试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；PARP抗体(Invitrogen公司)；p-Eif2α、Eif2α、p-IRE1抗体(Affinity公司)；IRE1、GAPDH抗体(Santa Cruz)；cleaved caspase-3抗体(Abcam公司)；三氯化铁、10%多聚甲醛与其他化学试剂(北京化工集团公司)。

1.1.4仪器 低温台式离心机(中国DLAB公司)；体外血栓形成仪(北京普利生仪器有限公司)；血小板聚集仪(北京普利生仪器有限公司)；化学发光图像分析仪(上海天能科技有限公司)；酶标仪(THERMO公司)。

1.2 方法

1.2.1实验动物分组 将SD大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、高剂量组和阳性对照组，每组8只。适应性饲养7天后连续灌胃给药7天，低剂量组大鼠每日给药0.2 g/kg，高剂量组大鼠每日给药0.4 g/kg，阳性对照组给复方丹参片0.26 g/kg，对照组和模型组给予等量生理盐水。

1.2.2含药血清的制备 给药组大鼠每日给药量为0.4 g/kg，阳性对照组给复方丹参片0.26 g/kg，空白对照组给予等量生理盐水，每日灌胃一次，连续给药7天。末次给药前12 h禁食不禁水。末次给药2 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3-0.5 g/kg)进行麻醉。打开腹腔分离开下腔静脉与腹主动脉，夹闭远心端使动脉膨起，使用采血针进行采血。全血4℃静置1 h，4℃ 3000 rpm离心10 min，分离血清，并将同组血清合并，56℃水浴灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤后-20℃保存。

1.2.3FeCl3诱导SD大鼠颈总动脉血栓形成 末次给药2 h后，用浸有50% FeCl3的滤纸条包裹动脉形成颈总动脉血栓，称重动脉血管段及血管重量，计算血栓重量及血栓抑制率。对照组以生理盐水替代FeCl3。

血栓抑制率(%)=(对照组血栓重量-给药组血栓重量)/对照组血栓重量×100%

1.2.4体外血栓形成试验 颈总动脉血栓造模后，对SD大鼠进行腹主动脉采血，利用体外血栓形成仪形成血栓，烘干后进行称重，并计算血栓抑制率。

1.2.5抗血小板凝集实验 颈总动脉血栓造模后，对SD大鼠进行腹主动脉采血，离心分离出富血小板血浆(PRP)和分离出的上层血浆即为贫血小板血浆(PPP)，利用血小板聚集仪检测血小板最大聚集率，计算血小板聚集抑制率。

血小板聚集抑制率(%)=(对照组平均聚集率-给药组平均聚集率)/对照组平均聚集率×100%

1.2.6ELISA法检测 颈总动脉血栓造模后，对SD大鼠进行腹主动脉采血，全血静置1 h，4℃ 3000 rpm离心10 min，分离血清，对TXB2、6-Keto-PGF1α、ET-1指标用ELISA法检测，指标检测操作均按照试剂盒使用说明书进行。

1.2.7H2O2诱导细胞氧化损伤模型 按4×103个/孔的密度将PC12、HUVEC细胞铺进96孔板中，正常培养24 h后更换为不同H2O2浓度的完全培养基，处理12 h，CCK-8试剂检测细胞活力。H2O2浓度如下：PC12细胞为0、200、300、400、500、800 μmol/L；HUVEC细胞0、600、700、800、900、1000 μmol/L。

1.2.8CCK-8法检测 按4×103个/孔的密度将细胞接种在96孔板中，分别按照空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组进行处理，CCK-8试剂检测细胞活力。各组处理如下：总血清浓度为15%，其中低剂量组、中剂量组、高剂量组含药血清浓度分别为5%、10%和15%，阳性对照组阳性血清含量为10%，其余血清用小牛血清补齐，处理24 h后，采用含H2O2的上述血清浓度的培养基处理12 h，H2O2浓度由上述实验确定。

1.2.9氧化应激指标 按1×105个/孔的密度将细胞接种在12孔板中，分别按照空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组进行处理，检测PC12、HUVEC细胞中LDH释放量和GSH、NO、SOD、MDA、ROS含量，操作均按照试剂盒使用说明书进行。

1.2.10Western Blot检测 按2×105个/孔的密度将细胞接种在6孔板中，分别按照空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组进行处理后，用lysis buffer收集细胞，反复冻融裂解细胞后离心，对上清液进行BCA蛋白定量，变性5 min后进行SDS-PAGE电泳，上样量为15 μg。电泳后进行转膜、封闭、孵育一抗和二抗，洗涤后进行ECL显影成像。

2 结果

2.1 血栓通脉胶囊对SD大鼠颈总动脉血栓重量的影响结果如表1所示，与对照组相比，50% FeCl3可造成SD大鼠颈总动脉血栓形成(P<0.01)；与模型组相比，血栓通脉胶囊及复方丹参片均可显著抑制血栓形成(P<0.01)。

表1 血栓通脉胶囊对FeCl3诱导SD大鼠颈总动脉血栓重量的影响

2.2 血栓通脉胶囊对SD大鼠体外血栓形成的影响结果如表2所示，与模型组相比，血栓通脉胶囊及复方丹参片均可显著抑制体外血栓形成(P<0.01)，低剂量组和高剂量组效果均超过阳性组。

表2 血栓通脉胶囊对SD大鼠体外血栓形成血栓重量的影响

2.3 血栓通脉胶囊对SD大鼠血小板聚集的影响结果如表3所示，与对照组相比，模型组血小板聚集率显著上升(P<0.01)；与模型组相比，血栓通脉胶囊及复方丹参片均可显著抑制血小板聚集(P<0.01)，且随剂量增加，抑制效果增强，其中高剂量组效果超过阳性对照组。

表3 血栓通脉胶囊对SD大鼠血小板聚集的影响

2.4 血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中TXB2、6-Keto-PGF1α、ET-1含量的影响与对照组相比，血栓模型组SD大鼠血清中6-Keto-PGF1α含量显著下降、TXB2、ET-1含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，血栓通脉胶囊和复方丹参片均可显著下调大鼠血清中TXB2、ET-1含量，并提高6-Keto-PGF1α含量(P<0.01)，见图1。

图1 血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中TXB2、6-Keto-PGF1α、ET-1含量的影响

2.5 H2O2诱导PC12、HUVEC细胞氧化损伤模型浓度的确定实验结果如图2所示，与对照组相比，细胞活力随着H2O2浓度的升高而下降。最终选择300 μmol/L H2O2作为PC12细胞的氧化损伤模型的处理浓度(P<0.05)，选择800 μmol/L H2O2作为HUVEC细胞的氧化损伤模型的处理浓度(P<0.01)。

图2 PC12、HUVEC细胞在不同浓度H2O2处理下细胞的活力比较

2.6 血栓通脉胶囊含药血清对PC12、HUVEC细胞活力的影响实验结果如图3所示，与对照组相比，不同浓度的血栓通脉胶囊含药血清对H2O2处理的细胞均有保护作用，除HUVEC细胞低浓度组外，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图3 不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对PC12、HUVEC细胞活力的影响

2.7 血栓通脉胶囊含药血清对PC12、HUVEC细胞LDH释放量和GSH、NO、SOD、MDA、ROS含量的影响实验结果如图4所示，与对照组相比，模型组的LDH、MDA、ROS指标有显著上调(P<0.05)，各个剂量的血栓通脉胶囊含药血清和阳性对照组均对H2O2的处理效果有抑制作用，除HUVEC细胞的LDH低剂量组外，抑制效果均有显著性差异(P<0.05)；GSH、NO、SOD 3个指标结果中，与对照组相比，模型组均有显著性下调(P<0.05)，各个剂量的血栓通脉胶囊含药血清和阳性对照组均对H2O2的处理效果有上调作用，其中阳性对照组在 PC12细胞中的GSH指标、HUVEC细胞中的SOD指标中没有显著性效果，HUVEC细胞的GSH低剂量组也无显著性效果。

图4 不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对PC12、HUVEC细胞中LDH释放量和GSH、NO、SOD、MDA、ROS含量的影响

2.8 血栓通脉胶囊含药血清对PC12、HUVEC细胞PARP、p-IRE1、IRE1、p-Eif2α、Eif2α、cleaved caspase-3和GAPDH表达水平的影响实验结果如图5所示，与对照组相比，模型组PARP、cleaved caspase-3、p-IRE1 p-Eif2α指标均有显著上调(P<0.05)，其中在PC12细胞中，血栓通脉胶囊含药血清的中剂量组对H2O2诱导的氧化损伤均有显著性抑制效果(P<0.05)；在HUVEC细胞中，血栓通脉胶囊含药血清对H2O2有道的氧化损伤有明显抑制效果，除 cleaved caspase-3外均有显著差异(P<0.05)。

图5 不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对PC12、HUVEC细胞中PARP、p-IRE1、IRE1、p-Eif2α、Eif2α、 cleaved Caspase-3和GAPDH蛋白指标的影响

3 讨论

血栓通脉胶囊以黄芪为君药，黄芪甲苷作为主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节免疫及脂肪代谢等作用[6]，且有研究证明黄芪甲苷可以改善动脉粥样硬化大鼠的血脂和炎症情况[7]，说明黄芪甲苷极有可能具有抗栓作用。

内皮细胞具有维持毛细血管通畅及其功能的关键作用，直接参与外周血管疾病、静脉血栓形成、中风、心脏病、糖尿病、慢性肾衰、肿瘤生长转移和严重病毒感染等疾病[8]。动脉血栓的形成主要与血小板功能异常、血管内膜损伤、凝血系统和纤溶系统发生病变等因素有关[9-11]。本实验选择以FeCl3处理大鼠颈总动脉诱导血栓形成模型来观察血栓通脉胶囊对血栓形成的影响及作用机制，FeCl3在局部浸润动脉可使血管内膜剥脱，内膜下组织暴露，通过Fe3+诱导氧自由基的产生，引发脂质过氧化，损伤血管内皮，促使血小板黏附、聚集并发生释放反应，激发凝血过程，导致血管混合性血栓形成[12]。实验结果显示，血栓通脉胶囊可显著抑制SD大鼠体内及体外血栓形成，同时可显著抑制SD大鼠血小板聚集，可显著提高6-Keto-PGF1α含量，而下调SD大鼠血清中TXB2、ET-1含量。

促氧化与抗氧化物质在体内均存在，在正常生理状态下，两者产生及消除氧自由基处于一种平衡状态。体内的氧自由基来源十分广泛，许多物质在一定条件下均可生成氧自由基。当机体或细胞受到损伤或刺激时，常常会导致促氧化物质生成增加，抗氧化物质减少，进而体内氧自由基大量产生却无法及时清除，导致发生氧化应激[13-14]。

H2O2是机体自然产生的重要活性氧之一，主要产生于血管壁中的血管内皮细胞、平滑肌细胞等处，易在体内环境下分解，产生氧自由基等成分，对细胞产生氧化损伤作用，是研究细胞氧化损伤的首选材料[15]。LDH是一种存在于细胞浆内的酶，在生命体的糖代谢中扮演重要角色。坏死的细胞胞膜破裂，使LDH被释放于培养液中，因此检测培养液中LDH的含量可用来表示培养细胞中坏死细胞的量[16]。GSH是一种体内重要的自由基清除剂和抗氧化剂，它可以把对机体有害的物质转化为对机体无害的物质，排出体外[17]，GSH的量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。NO可作用于血管平滑肌，使其松弛，扩张血管，同时NO还可与血液中的游离氧自由基结合，降低体内自由基数量[18]。SOD是机体内的一种抗氧化酶，主要负责清除机体内的氧自由基，在生物体内的含量多少是反应机体衰老与死亡的直观指标[19]。MDA，是膜脂过氧化最重要的产物之一，一般可以通过测定MDA含量来反应细胞膜脂过氧化的程度，以间接测定细胞膜系统的受损程度。以上指标及ROS均可反应细胞的氧化程度，故本实验选择以上六项作为衡量血栓通脉胶囊含药血清抗氧化能力的指标。

细胞凋亡时，多种凋亡相关因子被激活活化，并进一步激活下游因子，最终使底物蛋白分解，细胞崩解。Caspase-3是参与细胞凋亡过程的一种最重要的终末剪切酶，在细胞凋亡中发挥不可替代的重要作用。而PARP作为Caspase-3的主要作用底物，是一种用来修饰翻译后的多功能蛋白质的酶，可被损伤的DNA片段所激活，与DNA的损伤密切相关。内质网应激可通过激活未折叠蛋白反应等途径，来调控细胞的各种功能，而IRE1通路是内质网应激的主要通路之一。IRE1是一种内质网跨膜传感器，可通过激活未折叠蛋白反应，进而维持内质网和细胞的正常功能。虽然哺乳动物体内的IRE1可促进细胞存活，但它也可以通过抑制凋亡miRNA的衰变来启动细胞凋亡[20]。

本实验选择用H2O2处理HUVEC和PC12细胞作为考察对象，分别模拟内皮细胞及神经细胞的氧化损伤。实验结果表明，与对照组相比，不同浓度的血栓通脉胶囊含药血清均对H2O2处理的HUVEC和PC12细胞有保护作用，且随着含药血清浓度的提高，保护作用显著增强，差异具有统计学意义(P<0.05)。血栓通脉胶囊含药血清可显著降低HUVEC及PC12细胞的LDH、MDA、ROS含量，并提高GSH、NO、SOD含量，表明血栓通脉胶囊含药血清可减少细胞内LDH外溢，降低细胞的膜脂过氧化程度，减少细胞内活性氧的含量，而GSH、NO、SOD等抗氧化酶含量增高，提示血栓通脉胶囊含药血清具有一定的保护血管内皮细胞及神经细胞免受氧化损伤的能力。