海洋放线菌Streptomyces sp.AHMU XC 2026 次级代谢产物及其抗植物病原真菌活性研究

檀 振，刘意亿，张厚泽，王靖雯，农旭华*

（1.热带药用资源化学教育部重点实验室/海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158；2.热带药用植物化学海南省重点实验室/海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158）

海洋沉积物腐殖质含量丰富，是海洋微生物重要的栖息地之一。从海洋沉积物来源微生物次级代谢产物中寻找结构新颖的活性化合物是药物先导分子发现的重要途径。海洋放线菌分布广泛，种类多样，其活性次级代谢产物具有较强的药用潜力[1]。从现有的研究报道来看，海洋沉积物中的放线菌大多为链霉菌属。近年来，从海洋沉积物来源链霉菌中分离鉴定出生物碱、大环内酯、肽类等多种类型的次级代谢产物，表现出抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等显著的生物活性[2]。

植物病原真菌是农作物主要的病害，常常引起农作物发生枯萎病、炭疽病等，造成农作物减产[3]。目前的防控措施主要是通过使用化学农药来控制，如氟、砷等杀虫剂及滴滴涕等。然而，长期使用化学农药不仅使病原真菌产生耐药性，还引起严重的食品安全和环境污染问题[4]。因此，寻找高效安全的绿色替代农药是当前需要解决的问题，也是实现农业可持续发展的必然选择。海洋放线菌长期生活在高盐和低温等复杂环境，形成自身独特的代谢调控途径，次级代谢产物表现出结构多样性和显著的生物活性，是研制高效、环境友好型农药的宝贵资源[5]。本文以一株海洋沉积物来源放线菌为研究对象，从其次级代谢产物中分离鉴定10 个单体化合物，分别为cyclo-（trans-4-OH-D-Pro-D-Phe）（1），cyclo-（D-Pro-D-Phe）（2），cyclo-（L-Ala-L-Phe）（3），cyclo-（L-leucine-L-proline）（4），cyclo-（L-Leu-trans-4-hydroxy-L-Pro）（5），cyclo-（D-Pro-DIle）（6），trans-2-methylcinnamic acid（7），indole-3-carboxaldehyde（8），2-pyrrolecarboxylic acid（9），2-hydroxy phenyl acetic acid（10）（图1）。应用滤纸片扩散法对4 株植物病原真菌展开活性筛选，发现化合物10 在100µg/disc下对水稻稻瘟真菌Pyricularia oryzaeHNM 1003具有微弱的抑制活性，抑制圈直径为8 mm。

图1 化合物1～10的化学结构Figure 1 Chemical structures of compounds 1～10

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

核磁共振仪Bruker AV-400MHz，瑞士Bruker 公司；旋转蒸发仪EYELA N-1001，日本东京理化；冷却水循环装置EYELA COOLACE CA-IIII，日本东京理化；真空泵EYELA A-10000S，日本东京理化；制备高效液相色谱仪Agilent 1260 系列，色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18 column（250 mm×9.4 mm，5µm），美国安捷伦公司；硅胶（200～400目），青岛海洋化工厂产品。提取分离用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等均为工业用化学纯产品，重蒸后使用，高效液相制备流动相的甲醇为色谱级。

1.2 海洋放线菌Streptomyces sp. AHMU XC 2026 次级代谢产物的分离

1.2.1 菌种材料

菌株从连云港市海州湾-15 cm深海岸带（34.944°N 119.210°E）沉积物样品中分离得到，并通过16S序列比对进行菌种鉴定。

1.2.2 菌种发酵培养基

可溶性淀粉2%，葡萄糖1%，细菌学蛋白胨0.5%，酵母提取物0.5%，NaCl 0.4%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCO30.2%。

1.2.3 浸膏的提取发酵液经4 000 r/min离心得到菌液和菌体，菌液使用等体积的乙酸乙酯萃取3次得到浸膏；菌体使用丙酮萃取3次，再用乙酸乙酯反萃，得到浸膏；二者合并。

1.2.4 化合物的分离

浸膏5 g 用氯仿和甲醇溶解，过正相色谱柱，石油醚-乙酸乙酯两相体系作为洗脱液（V/V，10%，20%，30%，50%，100%），再用氯仿-甲醇体系（V/V，10%～30%）洗脱，经TLC 分析合并得到9个馏分（Fr.1～Fr.9）。馏分Fr.5（301 mg）过正相色谱柱，石油醚-乙酸乙酯为洗脱液（V/V，10%，20%，30%，50%，100%），经TLC分析合并得到3 个亚馏分（Fr.5-1～Fr.5-3）；亚馏分Fr.5-2 通过RP-HPLC 制备（流动相MeOH∶H2O = 55∶45，2 mL/min）得到化合物9（11mg，tR= 4.8 min）；亚馏分Fr.5-3 重结晶得到化合物10（151 mg）。馏分Fr.6（243 mg）过正相色谱柱，石油醚-乙酸乙酯体系洗脱（20%、30%、50%、100%），结合TLC分析合并得到4个亚馏分（Fr.6-1～Fr.6-4）；亚馏分Fr.6-2经RP-HPLC 制备（流动相MeOH∶H2O=45∶55，2 mL/min）得到化合物7（10 mg，tR=30 min）；亚馏分Fr.6-4经RP-HPLC 制备（流动相MeOH∶H2O=55∶45，2 mL/min）得到化合物8（20 mg，tR=2.4 min）。馏分Fr.8（1.83 g）过正相色谱柱，石油醚-乙酸乙酯体系洗脱（30%～100%），经TLC分析合并得到3个亚馏分（Fr.8-1～Fr.8-3）；亚馏分Fr.8-1由RP-HPLC 制备（流动相MeOH∶H2O=35∶65，2 mL/min）得到化合物6（27 mg，tR=5.2 min），4（116 mg，tR=10.3 min）和2（12 mg，tR=12.5 min）；亚馏分Fr.8-2重结晶得到化合物5（45 mg）。馏分Fr.9（2.13g）过正相色谱柱，氯仿-甲醇体系洗脱（V/V，10%～30%），经TLC分析合并得到4个亚馏分（Fr.9-1～Fr.9-4）；亚馏分Fr.9-2经RP-HPLC 制备（流动相MeOH∶H2O=27∶73，2 mL/min）得到化合物3（8 mg，tR=25 min）和1（50 mg，tR=27 min）。

1.3 抗植物病原真菌活性测试

按照文献[6]采用滤纸片扩散法，使用涂布棒把水稻稻瘟真菌Pyricularia oryzaeHNM 1003、芒果炭疽病菌Colletotrichum asianumHNM 408、橡胶树炭疽病菌Colletotrichum acutatumHNMRC 178 和香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporumHNM 1003 孢子均匀涂布在含PDA 培养基平板上。将单体化合物样品用DMSO 配制为20 mg/mL，待用。用打孔器将滤纸制成直径为6 mm的无菌小圆纸片，贴于准备好的含指示菌PDA培养基平板中。用定量移液枪吸取5µL待测化合物样品滴加在滤纸片上，置于28 ℃培养箱中培养24～48 h，观察是否产生抑菌圈。重复3次，同时以多菌灵为阳性对照，DMSO为空白对照。

2 结果与讨论

2. 1 菌株鉴定

以所提取的总DNA 为模板，利用通用引物27F（5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1525R（5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′）进行PCR扩增得到其16S rDNA序列，经纯化测序后，菌株Streptomycessp.XC2026的16S rDNA序列长度为1 517 bp（基因登录号为CP064057.1），通过比较基因序列的同源性，发现与Streptomycessp.ZJ306（基因登录号为KF954540.1）序列99%吻合，故鉴定为Streptomyces（图2）。

图2 放线菌Streptomyces sp.AHMU XC 2026的形态学特征Figure 2 Specific morphological characteristics of Streptomyces sp.AHMU XC 2026

2.2 单体化合物的波谱数据

化合物1：白色无定性粉末，ESI-MS数据为m/z283.1（［M+Na］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：7.29（5H，m，Ph），4.41（1H，m，H-4），4.32（1H，dd，J=6.4，11.2 Hz，H-6），4.20（1H，dd，J=4.8，5.2 Hz，H-9），3.53（1H，dd，J=4.8，12.4 Hz，H-3α），3.18（1H，d，J=12.4 Hz，H-3β），3.10（1H，dd，J=5.2，14.4 Hz，H-10a），3.03（1H，dd，J=4.8，14.4 Hz，H-10b），1.96（1H，dd，J=6.4，12.8 Hz，H-5a），1.53（1H，m，H-5b）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：169.6（C，C-1），165.3（C，C-7），137.3（C，C-11），129.9（CH，C-12，C-16），128.1（CH，C-13，C-15），126.4（CH，C-14），66.8（CH，C-4），57.0（CH，C-6），55.7（CH，C-9），53.9（CH2，C-3），37.3（CH2，C-5），35.3（CH2，C-10）。以上数据与文献报道[7]的基本一致，故鉴定该化合物为cyclo-（trans-4-OH-D-Pro-D-Phe）。

化合物2：白色无定性粉末，ESI-MS数据为m/z243.0（［M-H］-），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：7.26（5H，m，Ph），4.36（1H，t，J=5.2 Hz，H-9），4.00（1H，dd，J=6.8，9.6 Hz，H-6），3.39（1H，m，H-3a），3.35（1H，m，H-3b），3.09（1H，dd，J=5.2，14.4 Hz，H-10a），3.09（1H，dd，J=5.2，14.4 Hz，H-10b），2.03（1H，m，H-5a），1.75（1H，m，H-5b），1.71（1H，m，H-4a），1.44（1H，m，H-4b）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：169.0（C，C-1），165.1（C，C-7），137.2（C，C-11），129.9（CH，C-13，C-15），128.0（CH，C-12，C-16），126.4（CH，C-14），58.4（CH，C-6），55.7（CH，C-9），44.6（CH2，C-3），35.4（CH2，C-10），27.8（CH2，C-5），21.9（CH2，C-4）。以上数据与文献报道[7]的基本一致，故鉴定该化合物为cyclo-（D-Pro-D-Phe）。

化合物3：白色无定性粉末，ESI-MS 数据为m/z219.1（［M+H］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH7.29（5H，m，Ph），4.18（1H，m，H-3），3.63（1H，m，H-6），3.14（1H，dd，J=3.6，13.6 Hz，H-7a），2.87（1H，dd，J=4.8，13.6 Hz，H-7b），0.45（3H，d，J=7.2 Hz，H-14）；

13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：167.7（C，C-1），165.8（C，C-4），136.0（C，C-8），130.4（CH，C-9，C-13），128.1（CH，C-10，C-12），126.7（CH，C-11），55.3（CH，C-3），49.7（CH，C-6），38.3（CH2，C-7），19.7（CH3，C-14）。以上数据与文献报道[8]的基本一致，故鉴定该化合物为cyclo-（L-Ala-L-Phe）。

化合物4：白色无定性粉末，ESI-MS 数据为m/z211.2（［M+H］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：4.20（1H，t，J=8.0 Hz，H-6），4.01（1H，dd，J=5.6，6.4 Hz，H-9），3.39（2H，m，H-3），2.15（1H，m，H-5a），1.94（1H，m，H-5b），1.85（2H，m，H-4），1.81（2H，m，H-10），1.38（1H，m，H-11），0.87（3H，d，J= 6.4 Hz，H-12），0.86（3H，d，J=6.4 Hz，H-13）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：170.5（C，C-1），166.7（C，C-7），58.5（CH，C-6），52.7（CH，C-9），44.9（CH2，C-3），37.8（CH2，C-10），27.5（CH2，C-5），24.1（CH，C-11），22.9（CH2，C-4），22.5（CH3，C-12），22.0（CH3，C-13）。以上数据与文献报道[7]的基本一致，故鉴定该化合物为cyclo-（L-leucine-L-proline）。

化合物5：白色无定性粉末，ESI-MS数据为m/z249.1（［M+Na］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：8.00（1H，s，NH），5.12（1H，s，4-OH），4.41（1H，dd，J=3.5，10.8 Hz，H-6），4.29（1H，m，H-4），4.06（1H，t，J=6.0 Hz，H-9），3.50（1H，dd，J=4.4，12.4 Hz，H-3a），3.24（1H，d，J=12.4 Hz，H-3b），2.07（1H，dd，J=6.8，13.2 Hz，H-5a），1.96（1H，m，H-5b），1.87（1H，m，H-11），1.80（1H，m，H-10a），1.38（1H，m，H-10b），0.87（3H，d，J=6.4 Hz，H-12），0.86（3H，d，J=6.4 Hz，H-13）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：170.8（C，C-7），166.6（C，C-1），67.1（CH，C-4），57.1（CH，C-6），53.7（CH2，C-3），52.6（CH，C-9），37.8（CH2，C-10），36.7（CH2，C-5），24.1（CH，C-11），22.8（CH3，C-12），21.9（CH3，C-13）。以上数据与文献报道[9]的基本一致，故鉴定该化合物为cyclo-[L-Leu-trans-4-hydroxy-L-Pro]。

化合物6：白色无定性粉末，ESI-MS 数据为m/z219.1（［M+H］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：4.13（1H，dd，J=1.6，7.2 Hz，H-6），3.91（1H，brs，H-9），3.60（1H，m，H-3a），3.37（1H，m，H-3b），2.37（1H，m，H-10），2.16（1H，m，H-5a），1.88（1H，m，H-5b），1.82（2H，m，H-4），1.01（3H，d，J=7.2 Hz，H-11），0.85（3H，d，J= 7.2 Hz，H-12）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：170.3（C，C-1），165.3（C，C-7），59.5（CH，C-9），58.3（CH，C-6），44.7（CH2，C-3），27.9（CH，C-10），27.8（CH2，C-5），22.1（CH2，C-4），18.4（CH3，C-11），16.4（CH3，C-12）。以上数据与文献报道[7]的基本一致，故鉴定该化合物为cyclo-（D-Pro-DIle）。

化合物7：白色粉末，ESI-MS 数据为m/z162.2（［M+H］+），1H NMR（400 MHZ，DMSO-d6）δH：7.66（1H，d，J=15.6 Hz，H-3），7.54（1H，J=1.6，8.0 Hz，H-5），7.28（1H，overlapped，H-7），7.25（1H，overlapped，H-6），7.23（1H，overlapped，H-8），6.53（1H，d，J=15.6 Hz，H-2），2.36（3H，s，H3-10）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：166.7（C，C-1），136.7（C，C-5），136.5（CH，C-3），133.7（C，C-4），130.6（CH，C-6），129.1（CH，C-7），126.3（CH，C-8），125.9（CH，C-9），123.5（CH，C-2），19.3（CH3，C-10）。以上数据与文献报道[10]比对，鉴定该化合物为trans-2-methylcinnamic acid（反式-2-甲基-肉桂酸）。

化合物8：白色粉末，ESI-MS 数据为m/z151.1（［M-H］-），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：6.99（1H，td，J=1.6，7.6 Hz，H-7），6.92（1H，dd，J=1.6，7.6 Hz，H-8），6.65（1H，t，J=7.6 Hz，H-6），6.61（1H，d，J=7.6 Hz，H-5），3.19（2H，s，H-2）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：176.2（C，C-1），158.1（C，C-4），130.1（CH，C-8），127.1（CH，C-6），124.9（C，C-3），117.9（CH，C-7），117.0（CH，C-5），44.3（CH2，C-2）。以上数据与文献报道[11]的基本一致，故鉴定该化合物为2-hydroxy phenyl acetic acid（2-羟基苯乙酸）。

化合物9：白色无定形粉末，ESI-MS 数据为m/z146.0（［M+H］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：9.92（1H，s，H-8），8.28（1H，s，H-2），8.09（1H，d，J=7.6 Hz，H-4），7.53（1H，d，J=7.6 Hz，H-7），7.27（2H，overlapped，H-5，H-6）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：184.9（C，C-8），138.6（CH，C-2），137.1（C，C-7a），124.1（C，C-3a），123.4（CH，C-6），122.1（CH，C-5），120.8（CH，C-4），118.1（C，C-3），112.5（CH，C-7）。以上数据与文献报道[11]的基本一致，故鉴定该化合物为indole-3-carboxaldehyde（3-吲哚甲醛）。

化合物10：无色粉末，ESI-MS 数据为m/z110.2（［M-H］-），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：11.64（1H，s，NH），6.94（1H，dd，J=2.4，4.5 Hz，H-3），6.79（1H，br m，H-4），6.13（1H，J=2.4，8.4 Hz，H-5）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：162.7（C，C-6），123.9（CH，C-5），123.5（C，C-2），115.4（CH，C-3），110.0（CH，C-4）。以上数据与文献报道[12]的基本一致，故鉴定该化合物为2-pyrrolecarboxylic acid（2-吡咯甲酸）。

2.3 抗植物病原真菌活性结果

抗菌结果显示化合物10在100µg/disc条件下能够抑制Pyricularia oryzaeHNM 1003的生长，其抑制圈直径为8 mm，在相同条件下阳性对照多菌灵抑制直径为30 mm，DMSO 溶剂作为阴性对照未显示任何抑制活性。

3 结论

本文从海洋沉积物来源的放线菌Streptomycessp.AHMU XC 2026次级代谢产物中分离到10个单体化合物，包括6 个二酮哌嗪（1～6），反式-2-甲基-肉桂酸（7），2-羟基苯乙酸（8），3-吲哚甲醛（9）和2-吡咯甲酸（10），其中化合物7为首次从自然界中分离到的天然产物。对这些化合物的抗植物病原真菌活性筛选表明，化合物10对水稻稻瘟真菌Pyricularia oryzaeHNM 1003具有微弱的抑制活性，以它为模板修饰结构进而提高抗真菌活性还有挖掘的空间。同时，化合物10为该菌株主要的次级代谢产物之一，含量较高（3%以上），暗示着该化合物可能还有其它化学生态学功能。