芳香烃受体mRNA、白细胞介素22在2型糖尿病中的作用研究

刘艳秋, 范海迪, 孙 健, 薛 莲, 孟 月, 林 宁

(1. 江苏省淮安市第一人民医院分院 检验科, 江苏 淮安, 223002;2. 南京医科大学附属淮安第一医院 检验科, 江苏 淮安, 223300)

2型糖尿病(T2DM)的特点是胰岛β细胞功能失调或者胰岛素抵抗，传统的危险因素有高血压、肥胖和血脂异常等，慢性炎性反应也是其发病机制之一[1-2]。作为新的辅助型T淋巴细胞(Th细胞)亚群, Th22细胞主要分泌白细胞介素22 (IL-22)。Th22细胞与IL-22在恶性肿瘤、自身免疫性疾病及多种炎症疾病中发挥着重要作用[3]。蒋茂芹等[4]研究报道，胃癌组织中IL-22、白细胞介素22结合蛋白(IL-22BP)呈高表达，且二者表达水平与胃癌的侵袭和转移有关，或可协同促进胃癌的发生发展。在高糖导致的胰岛素抵抗和糖尿病并发症中，炎性介质起重要的作用[5]。研究[6-7]报道，当发生糖尿病和胰岛素抵抗时, c-Jun氨基末端激酶(JNK)和IKKβ/NF-κB 会激活，引起白细胞介素(IL)-6、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β等炎症因子的大量释放。大量的炎症因子会造成胰腺中β细胞破坏以及胰岛素抵抗的发生，因此炎症因子被认为是导致糖尿病并发症的主要因素[8-9]。本研究对2型糖尿病患者血液中Th22细胞转录因子芳香烃受体(AhR) mRNA水平及其功能分子IL-22进行检测，并分析其相关因素，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年7月—2020年7月在淮安市第一人民医院分院就诊的患者为研究对象并分为3组。① T2DM组纳入48例，患者均符合2010年中国糖尿病协会发布的糖尿病防治指南的诊断标准; 男25例，女23例，年龄37～78岁，平均(57.24±10.83)岁; 空腹血糖(FPG)≥ 7.0 mmol/L、餐后2 h血糖(2 hPG)≥ 11.1 mmol/L为糖尿病诊断标准。② 糖尿病前期组纳入49例，男24例，女25例，年龄35～75岁，平均(54.86±9.01)岁; 患者疾病类型分为空腹血糖受损(IGF)和糖耐量异常(IGT), IGF的诊断标准为FPG为6.1～6.9 mmol/L且 2 hPG<7.8 mmol/L, IGT的诊断标准为FPG<7.0 mmol/L且2 hPG为7.8～11.1 mmol/L。③ 选取同期在本院体检的健康者50例为对照组，男25例，女25例，年龄34～77岁，平均(55.12±10.99)岁。排除抗谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)、抗胰岛素抗体(IAA)、抗胰岛细胞抗体(ICA)阳性的成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)和1型糖尿病患者，排除合并糖尿病并发症、感染、肿瘤等患者。

1.2 研究方法

记录各组患者的身高、体质量，计算体质量指数(BMI); 应用Bio-Rad血红蛋白测试系统及离子交换高压液相法(HPLC)检测受试者全血中的糖化血红蛋白(HbA1c)水平。采用日立7600型自动生化分析仪测定空腹血清FPG、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、餐后血糖(PPG)和超敏C反应蛋白(hs-CRP)含量。血清空腹胰岛素(FINS)水平采用深圳新产业MAGLUMIX8型全自动化学发光仪检测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组血清IL-22水平，血清IL-22检测试剂盒购自美国Rapidbio(RB)公司。采集外周静脉血5 mL于EDTA抗凝管中，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法及淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(PBMCs)，利用Trizol法提取 PBMCs总RNA。

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定全血单个核细胞中AhRmRNA水平的表达，实时荧光定量PCR仪为美国NanoDrop公司ND-1000型，使用美国invitrogen公司RNA提取试剂盒，采用日本Takara公司生产的逆转录试剂盒及PCR定量反应试剂盒，测定试剂包括总RNA提取试剂Trizol、第1链cDNA反转录试剂盒和SYBR荧光定量试剂盒等。引物序列由上海生工生物技术有限公司设计并合成，序列如下:AhRmRNA的上游引物为5′-ACTCCACTTCAGCCACCATC-3′, 下游引物为 5′-ATGGGACTCGGCACAATAAA-3′, 扩增片段204 bp。内参采用β-actin: 上游引物为5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′, 下游引物为5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′, 扩增片段262 bp。

PCR实验结束后，设置阈值和基线，得出Ct值; Ct值是热循环仪检测到反应体系中荧光信号到达设定阈值所经历循环数, ΔCt实验组=(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参基因), ΔCt对照组= (Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因), 2-ΔCt即为各组目的基因的相对表达含量。PCR扩增产物的特异性通过溶解曲线分析，以此排除其他副反应产物(例如二聚体)的影响。计算各组目的基因AhRmRNA的相对表达含量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件对数据进行分析和处理。计量资料以均值±标准差表示，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，各指标间相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组一般资料比较

糖尿病前期组、T2DM组FBG、TG、PPG、HbA1c、hs-CRP均高于对照组, T2DM组HDL-C低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01); T2DM组FBG、TG、PPG、HbA1c高于糖尿病前期组, HDL-C低于糖尿病前期组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组一般资料比较

2.2 各组FINS、IL-22、AhR mRNA相对表达量比较

目的基因AhRmRNA与内参基因β-actin的溶解曲线均呈现单峰，证明引物的特异性良好，见图1。糖尿病前期组FINS、血清IL-22高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01); 糖尿病前期组AhRmRNA相对表达含量较对照组升高，但差异无统计学意义(P>0.05); T2DM组FINS、血清IL-22、AhRmRNA相对表达含量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01); T2DM组FINS、IL-22、AhRmRNA相对表达含量高于糖尿病前期组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

图1 AhR mRNA扩增曲线及溶解曲线

表2 各组FINS、IL-22、AhR mRNA相对表达量比较

2.3 Pearson相关性分析

AhRmRNA、IL-22与年龄、CHO、TG、LDL-C、BMI均无相关性(P>0.05), 与FBG、FINS、PPG、HbA1c、hs-CRP呈正相关(P<0.05或P<0.01), 见表3。

表3 AhR mRNA、IL-22与临床指标的相关性

3 讨 论

T2DM作为代谢性疾病之一，其发病率逐年上升，造成了严重的经济负担。因此，预防和治疗糖尿病意义重大。有关研究[10-12]表明，在存在胰岛素抵抗的糖尿病患者中, Th22细胞的数量及外周血IL-22 水平明显升高。有学者[13-14]研究发现, Th22细胞及其相关因子IL-22可促进糖尿病患者肥胖及脂肪组织炎症的发展，并参与胰岛素抵抗及加重血管壁损伤。唐雪娇等[15]研究发现，在高糖诱导心肌肥大的过程中，心肌细胞AhR的表达增加可能参与维持正常糖代谢过程，并且高糖环境能激活AhR转入细胞核内，从而上调细胞色素P450家族成员1A1(CYP1A1)的表达，以促进活性氧(ROS)的生成，这可能是导致高糖诱导心肌肥大的重要机制之一。AhR是一种被配体激活的转录因子，其在细胞生长、分化、免疫、凋亡等方面发挥功能，尤其在调控药物方面发挥非常重要的功能[16-17]。由于Th22细胞亚群主要效应细胞因子IL-22 的受体主要分布的部位是外周组织，因此被认为是直接向周围组织传递炎症效应信号的重要细胞亚群。BAKER N A等[18]、BILJES D等[19]实验证明AhR的表达异常将导致糖脂代谢失衡，说明AhR在机体调节糖脂代谢过程中起关键作用, AhR可能是糖尿病发病的关键因素。

研究[20-22]显示外周血Th22细胞除了特异性分泌IL-22以外，也可分泌IL-17、TNF-α等炎症因子，在自身免疫性疾病、炎症性疾病、恶性肿瘤患者血液中明显升高，并与病情严重程度及预后相关。IL-22在T2DM中的确切作用和机制尚不清楚，可能通过抑制氧化应激和内质网应激以及保护胰岛B细胞等调节葡萄糖代谢，也可能诱导免疫细胞分泌炎症因子而加剧慢性炎症反应[23]。HERDER C等[24]采用多因素调查显示IL-22水平与糖尿病的不同代谢状态不是独立相关的，血清IL-22水平也不是T2DM发病风险的独立相关因素, IL-22基因缺失并不会加重高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗。FABBRINI E等[11]认为IL-22可减轻胰岛素介导的抑制肝细胞葡萄糖生成作用，可以干扰肝脏的糖代谢，通过增加肝脏葡萄糖的产生而升高血糖。IL-22在2型糖尿病中的确切作用机制尚不完全明确，有可能通过抑制氧化应激和内质网应激以及保护胰岛B细胞来调节葡萄糖的代谢能力。本研究结果显示, T2DM组血清IL-22的表达水平高于糖尿病前期组及对照组，糖尿病前期组IL-22高于对照组，提示IL-22在糖尿病的发病机制中起着重要的作用;AhRmRNA、IL-22水平与FBG、FINS、PPG、HbA1c、hs-CRP呈正相关,AhRmRNA、IL-22可能与糖尿病的发生和发展有关。

综上所述，通过检测AhRmRNA、IL-22水平对T2DM患者进行病情评估和预后判断具有一定的临床意义,AhRmRNA、IL-22或可成为糖尿病治疗研究的新靶标。