黄芪桂枝五物汤防治深静脉血栓形成模型大鼠的实验研究

臧 鹏, 李进霞, 李 吉, 张慧芝, 谷 艳

(1. 山西省大同市第三人民医院 普通外科, 山西 大同, 037000;2. 山西大同大学医学院, 山西 大同, 037009)

深静脉血栓形成(DVT)是指血液在深静脉内异常凝结而阻塞血液回流，并引起静脉壁的炎性改变，是临床上常见的周围血管疾病。DVT好发于下肢，多见于高龄、制动、手术、创伤、恶性肿瘤、产后、口服避孕药等人群中。据研究[1-4]统计，血管疾病中DVT的发病率仅次于急性冠状动脉综合征、脑卒中，是第三大常见的血管疾病。中国有关DVT确切发病机制的文献报道较少，但随着中国居民生活水平的提高、人均寿命的延长，中国DVT的发病率有逐年升高的趋势[5-7]。若DVT患者得不到及时、有效的治疗，则可能会进展为血栓形成后综合征或血栓脱落导致肺栓塞，进而危及生命。

DVT属中医“股肿”范畴，脉络血瘀湿阻是其主要的病因病机，根据患者的临床分型可采用补气活血、温补脾肾、清热利湿的中药复方进行治疗[8]。黄芪桂枝五物汤是由黄芪、桂枝、芍药、生姜、大枣5味中药配伍而成，是治疗血痹的常用方剂。赵志丽等[9]运用黄芪桂枝五物汤辨治肺癌下肢静脉栓塞症，不仅显著改善了患者的临床症状，而且极大地缩短了深静脉血栓急性期、亚急性期病程。戴越保[10]发现黄芪桂枝五物汤可以有效地预防膝关节置换术后DVT, 且效果优于利伐沙班，具有良好的安全性。本研究采用黄芪桂枝五物汤干预DVT模型大鼠，观察其对模型大鼠凝血指标、血浆代谢产物以及血栓形成段组织形态学的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取40只无特定病原体(SPF)级SD大鼠，雄性，体质量180～220 g, 购自苏州西山生物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2019-0010。将大鼠适应性饲养1周后，随机分为假手术组、模型组、黄芪桂枝五物汤给药组(中药组)及低分子量肝素钙阳性对照组(肝素钙组)，每组10只。

1.2 药品及黄芪桂枝五物汤冻干粉制备

黄芪、桂枝、芍药、生姜、大枣均购自北京同仁堂大同连锁药店有限责任公司，由山西大同大学中医药健康服务学院柴茂山教授鉴定。低分子量肝素钙(万力舒，烟台东诚北方制药有限公司，国药准字H20153196)。按黄芪桂枝五物汤处方比例称取黄芪15 g、桂枝12 g、芍药12 g、生姜25 g、大枣4枚，加10倍量的水浸泡30 min, 煎煮1 h后倒出煎煮液; 再次加入8倍量的水复煎30 min, 合并2次煎煮液，经5层纱布过滤后冷冻干燥，即得冻干粉，得率约为20%。

1.3 主要试剂与仪器

氯化钠(SOLARBIO公司, CAS号: 7647-14-5), 大鼠D-二聚体ELISA试剂盒(酶免, MM-0623R1), 苏木素染液(中杉金桥, ZLI-9610), 伊红染色液(Solarbio, G1100), 超净高级封片胶(BASO, YZB), Scott蓝化液(Solarbio, G1865); 微量注射泵(kd Scientific, LEGATO 130), 凝血仪(广州万孚, NX-102), 台式离心机(Eppendorf, 5424R), 酶标仪(北京六一, WD-2102B), 显微镜(OLYMPUS, CX41), 切片机(Leica, 2235), 超高效液相色谱(Thermo Fisher Scientific, Vanquish), 高分辨质谱(Thermo Fisher Scientific, Q Exactive HFX)。

1.4 造模与给药

模型组、中药组及肝素钙组均参照文献[11]构建不完全结扎的大鼠股静脉血栓模型，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg), 待麻醉生效后，剃去大鼠腹股沟处鼠毛并消毒皮肤; 沿左腹股沟区中点做2 cm纵行切口，分离左股静脉，在左股静脉近心端处绕丝线行不完全结扎，使血管腔缩小约1/2以减慢血流; 从左股静脉远心端缓慢注入10%高渗盐水0.4 mL, 此时可观察到股静脉变为暗红色，提示血栓形成; 检查周围组织无出血后缝合切口，外敷消毒纱布[11]。假手术组不结扎、不给予高渗盐水刺激，其余操作同模型组。中药组给予药物冻干粉溶液2.0 g/(kg·d), 按每100 g为1 mL的比例灌胃; 肝素钙组给予低分子量肝素钙351.43 IU/(kg·d), 按每100 g为0.1 mL的比例皮下注射; 假手术组、模型组均以每100 g为1 mL的蒸馏水灌胃，各组大鼠给药时间均为造模前7 d至造模后7 d, 给药1次/d, 持续给药14 d。

1.5 样本采集与检测

治疗结束后的第1天，将各组大鼠用5%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血，置于冷水浴冷却的肝素抗凝管中，混匀，4 ℃下3 000 转/min离心10 min, 分离血浆并保存于-80 ℃冰箱中; 经原切口取出各组大鼠股静脉血栓段。将各组大鼠股静脉段进行常规固定、包埋、切片，行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察各组大鼠局部血栓形成静脉段组织形态学的差异。采用凝血仪及原装配套试剂检测各组大鼠血中活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)以及纤维蛋白原(FIB)水平; 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血中D-二聚体(D-D)水平。血浆代谢产物检测流程: 取血浆100 μL, 加入400 μL提取液[甲醇∶乙腈=1∶1的体积比(V/V)], 涡旋混合30 s, 12 000转/min离心15 min, 取上清液进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学比较

造模前7 d时，各组大鼠精神状况良好，四肢活动及饮食正常。造模后，假手术组大鼠精神状态良好，左下肢无明显肿胀，行动无明显受限; 其他3组大鼠造模后精神状况一般，左下肢明显肿胀、青紫，活动减少。持续给药7 d后，肝素钙组、中药组大鼠较模型组大鼠精神状态明显好转，左下肢血运明显改善，食欲增加，提示低分子量肝素钙和黄芪桂枝五物汤均能改善DVT大鼠的一般状态。

2.2 各组大鼠凝血指标比较

与假手术组比较，模型组大鼠FIB及D-D水平均升高, APTT、PT、TT均缩短，差异有统计学意义(P<0.05), 说明DVT大鼠体内处于高凝状态，容易产生血栓; 与模型组比较，肝素钙组、中药组FIB及D-D水平均下降, APTT、PT、TT均延长，差异有统计学意义(P<0.05), 说明低分子量肝素钙和黄芪桂枝五物汤均能增强大鼠体内的抗凝系统功能; 与肝素钙组比较，中药组D-D水平更低，差异有统计学意义(P<0.05), 说明黄芪桂枝五物汤对D-D的调节作用更为显著。见表1。

表1 各组大鼠凝血指标比较

与假手术组比较, *P<0.05; 与模型组比较, #P<0.05; 与肝素钙组比较, △P<0.05。

2.3 黄芪桂枝五物汤对DVT大鼠代谢紊乱的调节作用

对假手术组与模型组的血浆代谢产物进行单元统计分析，结果发现2组间共有27个变量存在统计学差异(筛选条件为fold change≤0.5或fold change≥2, 同时P<0.05), 这些差异代谢物反映了DVT大鼠的代谢紊乱情况。计算差异代谢物在中药组及肝素钙组中的均值，找寻各给药组中向假手术组有恢复趋势的代谢产物，并与模型组进行独立样本t检验分析。结果表明，治疗14 d后，黄芪桂枝五物汤可以使14种差异代谢物的水平趋向假手术组恢复，主要涉及改善维生素K、三甲基胺氮氧化物(TMAO)、鹅肌肽、L-肌肽、肉碱代谢、胆汁酸代谢和脂代谢等; 低分子量肝素钙可以使8种差异代谢物的水平趋向假手术组恢复，主要涉及TMAO、鹅肌肽、L-肌肽、肉碱代谢以及氨基酸代谢等。上述结果说明黄芪桂枝五物汤可以更全面地改善DVT大鼠的代谢异常。见表2。

表2 各组大鼠差异代谢物水平比较

2.4 各组大鼠静脉血栓段的组织形态学差异

假手术组静脉管腔中无血栓形成，管腔结构完整，内皮细胞排列整齐，管壁无水肿及炎性浸润; 模型组中静脉管腔被血栓填塞，管壁水肿增厚，内膜不规则，可见内皮细胞脱落，静脉壁与血栓粘连，炎性细胞浸润较为严重; 肝素钙组静脉管腔内部分血栓崩解，部分血栓收缩，血栓与静脉壁可见局限性粘连，血管内皮细胞可见部分脱落，静脉壁水肿及炎性细胞浸润较模型组轻; 中药组静脉管腔内血栓大部分崩解消失，残留少量血栓收缩，腔内再通明显，血栓与静脉壁无明显粘连，管壁结构较完整，内皮细胞脱落较少，管壁炎性细胞浸润较轻。见图1。

A、B: 假手术组; C、D: 模型组; E、F: 肝素钙组; G、H: 中药组。A、C、E、G放大倍数为100倍, B、D、F、H放大倍数为400倍。图1 各组大鼠静脉血栓的组织形态学差异(HE染色)

3 讨 论

DVT是临床上常见的周围血管疾病之一，是血液在下肢深静脉内异常凝结引起的静脉回流障碍性疾病，属于临床急危重症。目前，除导管溶栓、吸栓等介入手术外，药物溶栓和抗凝是DVT的主要治疗方法，可以有效抑制血栓的扩展，降低肺栓塞和血栓后综合征的发生率[13]。然而，西药在抗凝和溶栓的同时易引发出血等不良反应，例如胃肠出血、硬膜外血肿、腹膜后血肿等[14-16]; 肝素类抗凝药则必须静脉或皮下注射给药，操作繁琐; 口服抗凝药华法林的治疗效果易受多种食物和药物的影响; 利伐沙班(新型凝血因子抑制剂)的价格比较昂贵，在一定程度上限制了临床应用。

DVT属中医“股肿”范畴，脉络血瘀湿阻是该病的主要病机; 中医学认为气为血帅，气伤则血行不畅，气不畅则血行缓慢，以致瘀血阻于脉中。黄芪桂枝五物汤由黄芪、桂枝、芍药、生姜、大枣5味中药配伍而成，具有益气通经、活血通络之功效，可以有效防治DVT。凝血四项包括APTT、PT、TT以及FIB, 是临床上常用的检测凝血功能的指标，对疾病诊断具有重要的意义。APTT主要反映内源性凝血系统状况, PT主要反映外源性凝血系统状况, TT及FIB反映纤维蛋白原是否正常。APTT、PT、TT缩短提示机体处于高凝状态，容易发生血栓栓塞性疾病; 血浆FIB是纤维蛋白的前体，在凝血的最后阶段，可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，从而使血液凝固，FIB水平升高提示机体的凝血系统活性可能增强。

D-D是交联纤维蛋白的特异性降解产物之一，是继发性纤维蛋白溶解亢进的特有代谢产物。D-D水平与血栓的大小及活动性相关，发生下肢DVT的同时纤溶系统也被激活，血液中D-D水平升高[17], 因此D-D是下肢DVT的常用辅助诊断指标。本研究中，模型组大鼠APTT、PT、TT均显著缩短，而FIB、D-D显著升高，说明DVT模型大鼠体内存在高凝状态和继发性纤维蛋白溶解亢进。DVT模型大鼠经黄芪桂枝五物汤治疗后，APTT、PT、TT均显著延长，而血浆FIB、D-D水平均显著降低，且D-D水平较肝素钙组下降更为显著，说明黄芪桂枝五物汤具有显著的抗凝作用，可改善机体的高凝状态。

针对血浆代谢产物的分析发现，模型组中维生素K水平较假手术组显著升高，而维生素K具有促进凝血的作用，说明模型组大鼠处于高凝状态，而黄芪桂枝五物汤可能通过抑制DVT大鼠维生素K的吸收来下调维生素K水平，从而改善DVT大鼠的高凝状态。研究[18]报道TMAO可以促进动脉粥样硬化性血栓的形成，本研究发现模型组TMAO水平较假手术组显著升高，印证了TMAO与血栓形成的关联性，而黄芪桂枝五物汤可以显著下调TMAO水平。此外，与低分子量肝素钙相比，黄芪桂枝五物汤可以显著改善DVT大鼠体内的鹅肌肽、L-肌肽、肉碱代谢、胆汁酸代谢和脂代谢，说明中药对DVT的治疗效果更为全面。

本研究还通过组织形态学方法直观地观察了局部血管及血栓状态。本研究发现，模型组大鼠静脉管腔被血栓填塞，管壁水肿增厚，内膜不规则，可见内皮细胞脱落，静脉壁与血栓粘连，炎性细胞浸润较为严重; 肝素钙组静脉管腔内部分血栓崩解，部分血栓收缩，血栓与静脉壁可见局限性粘连，血管内皮细胞部分脱落，静脉壁水肿及炎性细胞浸润较模型组轻; 中药组静脉管腔内血栓大部分崩解消失，残留少量血栓收缩，腔内再通明显，血栓与静脉壁无明显粘连，管壁结构较完整，内皮细胞脱落较少，管壁炎性细胞浸润较轻。组织形态学结果证实了黄芪桂枝五物汤具有保护血管内皮细胞、抑制血栓形成、减少炎细胞浸润等作用。

综上所述，黄芪桂枝五物汤具有抗凝、改善代谢紊乱、抑制血栓形成、保护血管内皮细胞以及减轻炎性细胞浸润等作用，这可能是其治疗DVT的重要机制。