不同灭菌方式对商品乳外泌体完整性的影响

尚鹏远，曹业东，李和平，郭心雨，王月影，钟凯

(河南农业大学动物医学院，郑州 450000）

0 引言

外泌体，是直径在30～150 nm的膜性小囊泡，其内容物包括蛋白质、脂质、核酸分子等物质。外泌体通过将其内容物传递给受体细胞从而影响受体细胞的生理功能[1]。外泌体的结构和形态学特征较特殊，例如具有脂双层膜结构，密度为1.10～1.21 g/mL，通常在负染条件下呈现典型的“杯盘状”结构[2]。研究表明，外泌体已经在许多生物液中鉴定出，例如：血液，唾液和尿液[3-4]。在人类母乳和牛乳中也已鉴定出外泌体，乳汁中的外泌体大多为哺乳动物的乳腺上皮细胞（MEC）所释放的[5-8]。这些来自母乳的外泌体被母乳接受者系统地吸收，其在婴儿免疫系统的发展中发挥重要作用[9]。它们有助于调节新生婴儿的生长、组织成熟、代谢和免疫程序[10-11]。因此，外泌体系统或许是为母婴之间的信息交流而发展起来的，在哺乳动物幼崽出生后对其生长发育产生影响。

牛乳由于营养价值极高，成为人类重要的饮食来源，因此牛乳外泌体是我们日常生活中接触较多的外源外泌体。由于原料乳不是无菌的，而且可能含有病原体，为了使人们能够安全饮用牛乳，需要对牛乳进行灭菌[12]。目前，商品乳常用的灭菌方式有巴氏灭菌法和超高温瞬间灭菌法，巴氏灭菌法是在72～78℃，加热至少15 s[12]；UHT是135℃以上加热时间不少于1 s[13]。所有这些工业处理步骤都会对乳中生物活性成分产生影响，进而可能会影响它们的功能[14]。

研究报道，牛乳外泌体对初生幼仔具有免疫调节，促进肠道发育等功能，还可以作为一些疾病治疗药物的载体[15]，目前，尚不清楚热处理等工业加工步骤对牛乳外泌体会产生怎样的影响。因此，选取市场常见的巴氏灭菌乳和UHT乳，超速差速离心法提取外泌体，采用透射电镜（transmission electron microscopy,TEM），纳米颗粒示踪（nanosight analysis,NTA）法，以及western blotting法检测外泌体形态、粒径范围及标志蛋白的表达情况，探索工业加工对牛乳中外泌体的基本特征及生物活性的影响。

1 材料和方法

1.1 乳样采集

本试验所用商品乳均采购于本地超市，分别购买了3个品牌的巴氏灭菌乳（n=3）及超高温灭菌乳（n=3），生产日期相近，储存方式相同。生牛乳来自河南农业大学奶牛场（n=6）。

1.2 主要试剂

Phosphate Buffered Saline缓冲液,HyClong；浓盐酸、氢氧化钠、双蒸水、SDS聚丙烯酰胺凝胶试剂（去离子水，30%Arc-Bis，1.5 mol/L Tris-HCL(pH：8.8)、10%AP，TEMED，1 mol/L Tris-HCL,10%SDS）、BCA蛋白定量测定试剂盒（试剂A：BCA碱性溶液，试剂B：硫酸铜溶液，试剂C：标准BCA蛋白：1 mg/mL)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；一抗：小鼠Anti-CD63抗体、小鼠Anti-TSG101抗体,abcam；二抗：HRF-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)，武汉三鹰生物技术有限公司）；吐温-20、牛血清白蛋白，Solarbio；Omni-ETLTM超灵敏化学发光检测试剂盒，雅酶、ECL Femtolight Substrate、ECL Femtolight Oxidant等。

1.3 主要器材

HT-7700透射电镜，日本Hitachi；Nanosight NS300，Malvern；超速离心机（型号Optima XE-100 Ultracentrifuge,转子型号SW 40 Ti Rotor），BECKAMAN COULYER；pH仪，中国TIMEPOWER；高速离心机，德国Eppendorf；0.22μm针头式过滤器，中国biosharp；1、50、20 mL注射器，中国 曙光健士；BBA124S天平，中国OLABO；-80℃冰箱，日本SANYO；4℃立式冷藏柜;-20℃低温保存箱，中国Haier；微量移液器，德国Eppendorf；漩涡振荡器，IKA；恒温摇床，德国Eppendorf；电泳槽，转膜仪，GenScript；显影仪，Amersham Imager 600；酶标仪，Thermo等。

1.4 试验方法

1.4.1 差速超速离心法提取牛乳外泌体

离心机预冷至4℃，3 000g，离心10 min，弃去沉淀；上清转移至新的离心管中，2 000g，离心10 min，上清转移至新的离心管，重复一次；HCL和NaOH将样品pH调至4.7左右，4℃冰箱静置1 h；静置之后，10 000g，离心30 min，弃去沉淀，收集上清，转移至新的离心管中，重复两次；将得到的透明乳清用0.22μm过滤器过滤后，进行超高速离心，120 000g，4℃，离心70 min，将得到的外泌体富集于一个离心管，重复一次；将得到的外泌体用约500μL PBS吹打混匀，－80℃冰箱中冷冻保存。

1.4.2 透射电镜观察(TEM)外泌体形态

差速超速离心法分离组分用60～110μL 2%多聚甲醛重悬（4℃可保存一周）；然后滴5μL的外泌体悬液至铜网上，室温静置20 min；用PBS漂洗，5 min，3次；1%戊二醛固定5 min；双蒸水漂洗，2 min，10次；4%醋酸双氧轴负染5 min；滤纸吸取残液，室温晾干；上机观察。

“没错，是丁达。他没事，壶天晓和镜心羽衣也没事，都在他肚子里装着呢！”宴西园乘着他的棕色翼龙，低空盘旋着，向丁达飞去。

1.4.3 纳米颗粒示踪法（NTA）检测外泌体粒径范围

300μL的1×PBS进行重悬外泌体，得到外泌体重悬液；然后打开仪器电源、打开NTA 2.1 Analytical Software电脑软件；向外泌体重悬液加入10 mL的1×PBS溶液，得到二次稀释液；进行样品测试前，用纯水冲洗样品池；然后把样品打入样品池中，上机观察。

1.4.4 蛋白质免疫印迹检测

按照BCA试剂盒说明书对提取的外泌体浓度进行测定；外泌体溶液中加入5×SDS震荡混匀；99℃，10 min进行变性；样品进行10%聚丙烯凝胶电泳；转膜；BSA封闭；加入一抗孵育，TSG101（1∶2 000），CD63（0.5μg/mL）；洗膜；二抗（1∶5 000）孵育；洗膜；显影。

2 结果分析

2.1 不同灭菌方式商品乳中外泌体的形态学观察

透射电镜观察发现，生牛乳、UHT牛乳及巴氏灭菌乳中的外泌体均边缘清晰，部分有凹陷，近似球形，都有典型“杯盘”形态，如图1所示。不同的工业加工方式对透射电镜观察到的牛乳中外泌体的形态几乎没有影响。

图1 牛乳外泌体透射电镜观察

2.2 不同灭菌方式对商品乳中外泌体粒径范围的影响

生牛乳的外泌体粒径范围在70～300 nm，如图2所示，超出了正常外泌体地30～150 nm粒径范围，如图2所示。商品乳的外泌体粒径范围都在30～150 nm之间，如图3所示。不同牛乳外泌体的平均粒径和浓度如表1所示。从表中可以看出，生牛乳外泌体的平均粒径要极显著的大于巴氏灭菌乳和超高温灭菌乳外泌体的平均粒径（P＜0.0001）；两种灭菌方式的商品乳外泌体的平均粒径之间没有差异（P＞0.05），如图4（a）。巴氏灭菌乳和超高温灭菌乳的外泌体的浓度都要显著大于生牛乳外泌体的浓度（P＜0.05），不同灭菌方式的商品乳的外泌体浓度之间没有差异（P＞0.05），如图4（b）。由于生牛乳中存在许多微生物，他们可以吸附外泌体，导致外泌体发生了团聚现象，而经过灭菌之后，外泌体团散开成为单个的外泌体，所以生牛乳外泌体与灭菌乳外泌体相比，平均粒径偏大，浓度偏小。

图4 外泌体平均粒径和浓度分析

表1 不同品牌商品乳外泌体的平均粒径和浓度

图2 生牛乳外泌体的粒径分布

图3 不同品牌商品乳外泌体的粒径分布

2.3 Western blot分析

图5 WB条带图

3 结果与讨论

牛乳是哺乳动物幼仔最主要的营养物质来源，牛乳中富含生物活性成分对新生幼仔的肠道发育和自身免疫的建立具有重要作用。外泌体是新近发现的牛乳中有一种具有生物活性的成分，有研究表明，外泌体在新生儿的胃肠道和免疫系统的发育中同样发挥重要作用[16-18]。但是，在流行病学研究中发现成人过多的摄入巴氏灭菌牛乳可能会增加肥胖[19-20]、Ⅱ型糖尿病[21]、骨质疏松症[22-23]、常见癌症（直肠癌[24]、乳腺癌[25]等）以及帕金森等疾病[26]的发病风险,其原因很可能是牛乳中富含的外泌体所导致的，因此，有研究者提出，巴氏灭菌牛乳中的外泌体也许是不应该到达人类食物链的新的病原体[27]。

牛乳中的外泌体对于人类，特别是成人健康的影响是利还是弊目前存在分歧[27]。人们日常饮用的牛乳都是经过工业加工的商品乳。商品乳中的外泌体是否受到了工业加工的影响，是否仍具有生物学活性目前仍无定论[28-29]。因此，本研究从生牛乳、巴氏灭菌乳、UHT乳中分离的外泌体，比较其基本生物学特征的的差异，推测其生物活性可能改变。

本实验采用稍加改进的差速超速离心法分离牛乳中的外泌体，由于牛奶中含有大量的蛋白，我们利用蛋白质的等电点沉淀法，先将牛奶的pH调至4.7左右，使乳中含量最多的酪蛋白沉淀，然后对乳清进行差速超速离心从而得到外泌体。

通过透射电镜观察，我们发现从生牛乳和两种灭菌方式的商品乳中分离的外泌体形态上没有差异，都呈现典型的“杯盘”状外观。但是之前有研究者报道，运用冷冻电镜对不同灭菌方式的商品乳中的外泌体进行观察，生牛乳中分离的外泌体呈“杯盘”状，脂质双层清晰；而巴氏灭菌牛乳中分离的外泌体呈不完全球形，膜完整性受到影响；在UHT乳中已经观察不到完整的外泌体[30]。这表明采用不同实验手段对外泌体形态学观察结果将产生影响。

对不同灭菌方式商品乳外泌体的粒径范围和浓度的研究中，我们发现商品乳的外泌体粒径都在30～150 nm之间，平均粒径都在72 nm左右，结果提示我们不同加工方式对于牛乳外泌体粒径范围没有影响。但是，本研究中生牛乳外泌体的粒径范围在70～300 nm，超出了正常外泌体30～150 nm的范围，原因可能使因为生牛乳中含有较多微生物，微生物可以吸附外泌体，使外泌体出现团聚现象。通过比较巴氏灭菌乳和UHT乳中外泌体的浓度，我们发现UHT乳外泌体的浓度都要比巴氏灭菌乳外泌体的浓度高，不同品牌的商品乳趋势一致，这与粒径范围的变化相一致。

通过检测商品乳和生牛乳外泌体进行标志性蛋白，我们发现商品乳中外泌体的蛋白信号与生牛乳外泌体蛋白信号相比，下降许多。外泌体相关蛋白的信号减弱可能是由于检测抗体缺乏对表位的识别所致。事实上，一些牛奶蛋白是热敏性的，加热会导致这些蛋白的变性、聚集和糖基化，可能会阻碍抗体结合，从而限制了在蛋白质印迹分析中的检测[30-31]。但是结果显示TSG101的信号强度要明显比CD63的信号强，推测可能由于TSG101蛋白的热稳定要比CD63蛋白好。有研究表明，商品乳外泌体中的大部分的含量有所减少[30]。本实验因提出的商品乳外泌体中的miRNA浓度太低，未能对miRNA进行定量检测，这也说明了工业加工将对乳中外泌体产生影响。

本研究对不同灭菌方式的牛乳外泌体进行形态，粒径，数量和一些标志蛋白的检测，结果表明，工业加工对乳中外泌体的完整性产生影响，进而将影响外泌体的生物活性。不同乳制品对人类健康的影响是复杂多样的，需要更进一步的深入研究。