干酪乳杆菌Zhang在不同温度下的膜脂肪酸变化分析

包秋华，代利霞，梅迩蓝

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，农业农村部奶制品加工重点实验室，呼和浩特 010018)

0 引言

益生菌菌株在食品工业中的成功应用取决于它们的功能特性，而功能特性的发挥需要保证益生菌菌株以存活状态进入人体肠道[1]。乳酸菌在生产和应用过程中不可避免会受到不利于生存的环境条件变化的影响，如温度、酸碱度、渗透压、射线、寡营养、电解质和氧化剂等[2]。这些因素可能会引起乳酸菌基因型和表型发生一系列的生理变化[3]。其中温度是对乳酸菌生长最具影响的环境因素。当在最适生长温度下，繁殖速率最快，细胞结构完整，生长状态最好，当高于或低于最适生长温度时，乳酸菌会激活多种应激反应去应对不利生存的条件来抵抗胁迫[4-7]。Hermien V B[8]将植物乳杆菌置于28℃和40℃进行温度胁迫，发现两种转录调节因子有助于调节菌株对温度胁迫的抗性，进而对其应激调节机制进行阐述。Correa D M A[9]对鼠李糖乳杆菌CRL 1505进行了耐热性研究，55℃下处理20 min，细胞存活率没有显著变化，显示出了高的内在耐热性可见菌体对此逆境条件产生了耐热机制。

细胞膜是菌体与外界环境隔离的主要屏障，当温度发生剧烈变化时，细胞膜是首先感知到外界环境压力的部位，也是首先被伤害的目标基质，这种伤害体现在破坏细胞膜的完整性。研究发现微生物的自我调节机制与细胞膜不饱和脂肪酸也有密切关系，细胞膜中的不饱和脂肪酸含量的增加可以增强微生物在温度变化过程中细胞膜的流动性，起到维持细胞膜的功能，从而提高微生物的抗逆性[10-12]，张爱静[13]通过热胁迫处理E.coil ATCC43889菌株，发现随着温度的升高，个体形态变长，生物被膜生成能力增强，饱和脂肪酸含量升高，不饱和脂肪酸含量下降，菌株耐热性增强。乳酸菌在温度变化过程中也可以通过改变细胞膜脂肪酸的含量与组分，调节细胞膜的流动性去维持菌株正常生长，减免损伤[14-15]。李宝坤[16]通过对罗伊氏乳酸杆菌冷热胁迫处理后，采用Bligh&Dyer法对脂肪酸进行提取，发现罗伊氏乳酸杆菌CICC 6226菌体中的不饱和脂肪酸比例上升，而在此条件下菌体的存活率也最高，推断在冷热胁迫条件下，罗伊氏乳酸杆菌对此逆境产生了保护机制，这种机制产生后会对细胞膜脂肪酸的含量及组分产生很大的影响，对微生物环境适应性和应激胁迫响应机制的探究具有重要意义，对保障食品安全及企业面临的生产问题有一定的改善。

干酪乳杆菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang，Lb.casei Zhang）是一株从传统酸马奶中分离的益生菌，经过严格的科学实验，对该菌的生理特性、益生功效、分子机理、生产性能等一系列关键技术进行了攻关研究，取得了重大突破，并证明了其安全性，且已市场化应用[17-18]。本文通过研究逆境条件下干酪乳杆菌Zhang膜脂肪酸的变化，从而探究其是否具有抵御不良生存环境下的应激机制。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：干酪乳杆菌Zhang（Lb.casei Zhang），内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库保存并提供。

试剂：液体MRS、固体MRS、生理盐水、氯仿-甲醇溶液、氯仿、甲醇钠-甲醇、正己烷。

1.2 仪器

DHP-9272恒温培养箱，上海恒科有限公司；Eppendorf 5810 R离心机，德国Eppendorf公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌锅，日本三洋公司；气相色谱仪6850型，美国Agilent公司；EYELA MG-2200氮吹仪，日本。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株活化

将Lb.casei Zhang以2%的接种量接入MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱培养18～24 h，活化到第三代后，将对数生长末期的菌体通过革兰氏染色进行形态观察和电镜扫描观察微观结构。

1.3.2 不同温度条件Lb.casei Zhang的处理

将活化的菌液分装到50 mL离心管中，5 000 g离心5 min，弃上清，加入适量生理盐水洗菌，离心后收集菌泥，把预热好的45、60、70℃MRS液体培养基分别倒入50 mL离心管中，在对应温度下对Lb.casei Zhang热处理5、10、30 min，同时在37℃下做对照试验。

1.3.3 不同温度条件Lb.casei Zhang活菌数量变化

在不同温度条件下，采用稀释平板计数法检测Lb.casei Zhang在0、6、12、18 h的活菌数量，每次试验重复3次，每次试验3个平行。

1.3.4 膜脂肪酸的提取及甲酯化

对4种不同温度处理的Lb.casei Zhang分别在0、6、12、18 h进行取样，并采用Bligh&Dyer法[16]提取细胞膜脂肪酸并进行甲酯化。

1.3.5 脂肪酸组分和含量的测定

采用Agilent 6850气相色谱仪对样品进行脂肪酸检测。先用37种脂肪酸甲酯标准品(Supelco 47885-U)定标，得到了能够检测37种脂肪酸甲酯标准品的最佳气相检测条件，然后通过气相色谱法检测Lb.casei Zhang在不同温度条件不同时间的细胞膜脂肪酸组分和含量，每个样品重复测定3次。

检测条件：色谱柱为定制Agilent公司毛细填充管，填充物为（88%-氰丙基）芳基-聚硅氧烷，规格60 m×0.25 mm i.d×0.25μm film；载气：氮气(纯度为99.999%)；进样口温度：260℃；柱温升温程序：初始温度80℃，保持1 min，随后以6.5℃/min速率增至170℃，以2.75℃/min速率增至215℃，并保持2 min，以40℃/min速率增至230℃，并保持2 min；氢气流量35 mL/min、空气流量350 mL/min、氮气流量35 mL/min；检测器为氢火焰离子检测器，检测器温度260℃；进样量1μL，分流比1∶5。

1.3.6 数据分析

将待测样本的脂肪酸色谱图与标准色谱图进行分析比较，确定待测样品中脂肪酸组分，并用面积归一化法(以峰值面积的百分比表示)确定各种脂肪酸的百分含量[19]。上述所有数据均采用SPSS等软件计算平均值和标准差，并用Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 Lb.casei Zhang的细胞形态学观察

将活化第三代的Lb.casei Zhang进行革兰氏染色和扫描电镜观察，结果见图1。

图1 Lb.casei Zhang的细胞形态学观察

通过图1可以看出，Lb.casei Zhang为革兰氏阳性短杆菌，大小形态均一，没有其他杂菌的图样，可以用于后续实验。

2.2 Lb.casei Zhang在不同温度条件下活菌数变化结果

对Lb.casei Zhang进行不同温度处理后，不同时间点的活菌数变化情况见图2。结果显示在不同温度处理下，活菌数变化规律均不同。37℃和45℃处理时活菌数变化趋势总体平稳，变化幅度较小，但37℃在0～18 h内先略微增加然后开始下降；60℃和70℃处理时活菌数在0～6 h出现大幅度下降，而在6～18 h出现缓慢降低，整体呈现下降趋势。

图2 不同温度胁迫下Lb.casei Zhang活菌数变化结果图

2.3 Lb.casei Zhang在不同温度条件下膜脂肪酸组分和含量的检测

通过气相色谱法检测Lb.casei Zhang在不同温度条件下不同时间点处理的脂肪酸，部分脂肪酸变化峰图结果见图3。从色谱图的峰形、基线等方面看，数据很好，可信度高。

通过脂肪酸的气相色谱图可以看出脂肪酸含量发生了显著变化。从图3可以看出，Lb.casei Zhang在温度为45℃处理0 h时油酸（C18∶1n9c）的峰高（出峰时间20.693 min）高于18 h（出峰时间20.673 min）的峰高。

图3 Lb.casei Zhang在不同温度条件下的脂肪酸气相色谱图

在不同温度条件下，通过气相色谱法测出主要发生变化的脂肪酸有5种∶肉豆蔻酸（C14∶0）、棕榈酸（C16∶0）、棕榈油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1n9c）、亚油酸（C18∶2），这5种脂肪酸占总细胞膜脂肪酸的比例最大。不同温度条件下饱和脂肪酸中以棕榈酸为主，含量约占总细胞膜脂肪酸含量的28%，而不饱和脂肪酸中以亚油酸为主，占总膜脂肪酸含量的31.49%，脂肪酸种类见表1。

表1 Lb.casei Zhang的脂肪酸种类

2.4 不同温度条件下Lb.casei Zhang细胞膜脂肪酸的变化分析

Lb.casei Zhang在不同温度条件处理下不同时间点的膜脂肪酸相对百分含量变化，结果见表2。

表2 Lb.casei Zhang不同温度下脂肪酸变化

（续表2）

由表2可见，Lb.casei Zhang在不同温度下18 h内细胞膜中含量相对较高的5种脂肪酸变化均显著，其中棕榈酸（C16:0）是Lb.casei Zhang细胞膜的主要饱和脂肪酸，变化范围在(25.28±0.12)%～(33.03±0.60)%，其次是肉豆蔻酸（C14∶0）。亚油酸（C18∶2）是主要的不饱和脂肪酸，变化范围在(28.49±0.47)%～(37.24±0.62)%。

2.4.1 37℃条件下Lb.casei Zhang脂肪酸组分和含量变化

在37℃时，Lb.casei Zhang 5种脂肪酸相对百分含量以及总不饱和脂肪酸和总饱和脂肪酸相对百分含量的对比分析，结果见图4。

图4 干酪乳杆菌Zhang在37℃条件下脂肪酸组分和含量变化

从图4(a)可以看到，37℃条件下各脂肪酸相对百分含量随时间的变化比较明显，油酸（C18∶1n9c）和亚油酸（C18∶2）随着时间的增加相对百分含量出现减少，而且变化浮动较大，在6 h之后基本平稳，仅出现略微的变化。肉豆蔻酸（C14∶0）、棕榈酸（C16∶0）、棕榈油酸（C16∶1）在0～6 h均出现了增幅，棕榈酸（C16∶0）的增加幅度较大，且在6 h之后开始下降。此外，从图4(b)中可以直观的看出37℃条件下总饱和脂肪酸与总不饱和脂肪酸的相对百分含量变化，总不饱和脂肪酸在0～18 h内先减少后出现了增加，但增加幅度较小，总饱和脂肪酸相反，呈现先增加后减少的趋势。

2.4.2 45℃条件下Lb.casei Zhang脂肪酸组分和含量变化

对Lb.casei Zhang在温度为45℃时各脂肪酸相对百分含量以及总不饱和脂肪酸和总饱和脂肪酸相对百分含量进行了对比分析，结果见图5。

图5 干酪乳杆菌Zhang在45℃条件下脂肪酸组分和含量变化

从图5（a）可以看到，45℃条件下各脂肪酸相对百分含量随时间的变化，肉豆蔻酸（C14∶0）、棕榈酸（C16∶0）和亚油酸（C18∶2）在0～6 h脂肪酸相对百分含量均出现了增加，油酸（C18∶1n9c）和棕榈油酸（C16∶1）出现了下降，油酸的变化浮动较大，在6 h之后基本平稳，仅出现略微的变化。并且从图5（b）中可以直观的看到45℃下总饱和脂肪酸与总不饱和脂肪酸的变化，总不饱和脂肪酸在时间0～18 h内先减少后增加，总体趋势为增加，总饱和脂肪酸相反，先出现增加然后减少。

2.4.3 60℃条件下Lb.casei Zhang脂肪酸组分和含量变化

对Lb.casei Zhang在温度为60℃时各脂肪酸相对百分含量以及总不饱和脂肪酸和总饱和脂肪酸相对百分含量进行了对比分析，结果见图6。

图6 干酪乳杆菌Zhang在60℃条件下脂肪酸组分和含量变化图

从图6（a）可以看到，60℃条件下各脂肪酸相对百分含量随时间的变化，肉豆蔻酸（C14∶0）、棕榈酸（C16∶0）、棕榈油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1n9c）在0～6 h随着时间的变化相对百分含量出现减少，亚油酸（C18∶2）相对百分含量出现增加，之后的变化也不显著，并且从图6（b）可以直观的看出60℃下饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的变化，总不饱和脂肪酸在时间0～18 h内逐渐增加，但增加幅度较小，总饱和脂肪酸相反，这一结论与Ma YL[20]的研究结果相似。

2.4.4 70℃条件下Lb.casei Zhang脂肪酸组分和含量变化

对Lb.casei Zhang在温度为70℃时各脂肪酸相对百分含量以及总不饱和脂肪酸和总饱和脂肪酸相对百分含量进行了对比分析，结果见图7。

从图7（a）可以看到，70℃条件下各脂肪酸相对百分含量随时间的变化，棕榈酸（C16:0）和油酸（C18:1n9c）在0～6 h先增加，从第6 h开始出现降低的趋势，然后在12 h呈现略微的增加，肉豆蔻酸（C14:0）和亚油酸（C18:2）随着时间的增加相对百分含量出现减少—增加—减少的趋势，而棕榈油酸（C16:1）在0～18h内相对百分含量的变化很微弱，且含量较低。此外，从图7（b）中可以直观的看出70℃下饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的变化，总不饱和脂肪酸在时间0～18 h内先减少后出现了增加，但增加幅度较小，总饱和脂肪酸相反，先增加后减少。

图7 干酪乳杆菌Zhang在70℃条件下脂肪酸组分和含量变化

3 讨论

当乳酸菌处于不同温度胁迫下，它会激活多种应激反应去抵抗这些不适生长温度的胁迫，其中细胞膜脂肪酸组成与含量的改变是其中一种，是细菌在不利条件下保持生存能力的重要保证。本研究中通过对Lb.casei Zhang在45、60、70℃条件下进行热激处理，随着处理温度的升高，Lb.casei Zhang的存活率明显降低；细胞膜脂中不饱和脂肪酸含量增加，而饱和脂肪酸含量减少，推断Lb.casei Zhang在热激处理条件下产生了抗逆性，为抵御高温环境下的伤害，Lb.casei Zhang通过改变细胞膜脂肪酸组分和含量，增加细胞膜流动性来适应环境变化。这一结果与Vaessen E M J[21]，Haddaji N[22]等研究结果一致，乳酸菌在逆境条件下，发生了应激反应，SFA/USFA(饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸）比率下降，以及细胞膜流动性随着处理温度的升高而增加。阿根廷一位研究人员Gomez Z A[23]对8株嗜热乳酸杆菌的脂肪酸组成和抗冻融性进行了研究，在-20℃与37℃下反复冻融循环，测定细胞膜中脂肪酸的比例以及饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的变化，发现C19∶0的增加可以使细胞免受冻融损伤。我们的研究中发现，当Lb.casei Zhang在45、60、70℃处理下，主要通过C18∶2(亚油酸）的增加来使细胞免受热激损伤。Kentaro T[24]研究发现一些耐冷细菌响应生长环境变化也是通过调节它们的脂肪酸组成，因此脂肪酸组成的调节被认为是维持膜流动性所必需的。这也从侧面解释了我国具有自主知识产权的益生菌Lb.casei Zhang对热有一定耐受性的机理。

实际生活中我们会尽可能避免含乳酸菌的食品受到不利环境的影响，而在工业生产中，会有意将乳酸菌置于胁迫条件下，将乳酸菌接种到腌制食品中，也就是高渗透压环境，可以提高乳酸菌不饱和脂肪酸的含量，降低饱和脂肪酸的含量，改善腌制食品的品质以及风味质量[25]，而且经过热激处理的菌株，在制备发酵乳的过程中，会使发酵乳的后酸化显著下降，对于提高发酵乳产品货架期具有十分重要的现实意义[26]。利用这些胁迫响应可以生产出高质量的发酵食品，包括干酪、葡萄酒、酸奶、焙烤食品等。

4 结论

本研究通过在不同温度下对Lb.casei Zhang进行胁迫处理，采用Agilen 6850气相色谱仪和60米的色谱柱成功检测了其脂肪酸种类和含量的变化，并对饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸相对百分含量进行了研究。得到以下结论：在不同温度胁迫下，主要发生变化的5种脂肪酸是肉豆蔻酸（C14∶0）、棕榈酸（C16∶0）、棕榈油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1n9c）、亚油酸（C18∶2）。从相对百分含量上看，不饱和脂肪酸含量增加，饱和脂肪酸含量减少，推测Lb.casei Zhang为应对不良环境变化，通过增加不饱和脂肪酸含量来改变细胞膜流动性，增加细胞活性，起到了维持细胞膜的功能，从而提高了微生物的抗逆性，初步解析了Lb.casei Zhang具有抵御不良生存环境下的应激机制。