鲤幼鱼耳石荧光化合物和锶复合标记研究

邱 晨，姜 涛，陈修报，刘洪波，杨 健1,

（1.南京农业大学无锡渔业学院， 江苏 无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心渔业微化学研究室，江苏 无锡 214081；3.沅江市南大膳镇人民政府，湖南 沅江 413100）

鱼类增殖放流是加强生态环境保护和渔业资源养护的关键手段之一，但放流后客观的效果评价却是一个无法回避的难题。这就需要合适的放流标记技术来有效解决。目前，已有很多放流标记的方法（如挂牌法、分子标记法等），但各有优缺点[1]。因此，需要进一步优选标记模式，尤其是针对早期生活史的规模化标记模式。目前的研究通常仅利用荧光物质或锶（Sr）等对水生生物进行了单一标记[2-5]。然而，在探索研究和实际生产中，为了使一次标记获得更多研究成果，节省多次标记的重复操作，同时也为了使呈现的结果更易被观察，笔者认为利用不同标记物对同一批次鱼进行耳石复合标记具有更大的应用潜力，但相关方面的报道却较为少见。为此，该研究选用早期生活史鲤（Cyprinus carpio）幼鱼为对象，尝试利用茜素络合物（alizarin complexone ，ALC）和六水氯化锶（SrCl2·6H2O）混合溶液对鲤幼鱼进行浸泡，进而比较其3 对耳石[矢耳石（Sagitta）、微耳石（Lapillus）和星耳石（Asteriscus）]的ALC-Sr 复合标记效果，得到最佳标记耳石样本，规范及优化鲤鱼耳石荧光-Sr 复合标记条件，为实现多样化地增殖放流标记模式提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

20 尾人工繁殖的健康鲤幼鱼采集自江苏省无锡市中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南区实验基地，试验前供试鱼均暂养于盛有曝气2 d 以上的自来水的玻璃缸中，暂养期间不投饵。供试试剂有ALC（上海生工生物工程股份有限公司）、SrCl2·6H2O（分析纯，上海抚生实业有限公司）。整个试验均在中国水产科学研究院长江中下游渔业生态环境评价与资源养护重点实验室自主研发的耳石化学标记系统（LFEROM-1901 型，中国水产科学研究院淡水渔业研究中心）中进行。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计与样本采集在一个玻璃标记缸内配制15 L 的200 mg/L ALC 和80 mg/L SrCl2·6H2O（配置浓度的准确性经电感耦合等离子质谱仪确认）的混合溶液，同时设置对照组。随机捕取暂养后规格基本一致的10 尾鲤幼鱼，平均体重（2.49±0.35） g，平均全长（60.98±2.68） mm，分别放入对照组和标记组的标记缸内进行2 d 的浸泡标记处理。浸泡标记期间向试验水体中充气增氧，但不喂食。待浸泡标记结束后，将对照组和标记组的鲤幼鱼分别置于一个盛有100 L曝气自来水的后续饲养缸中恢复续养，投喂普通配合饲料。待恢复续养20 d 时进行取样，测量其全长与体重后保存，以待后期标记检测。试验期间不控水温和光周期，每日清理排泄物，并更换1/4 的养殖水体。

1.2.2 耳石摘取、处理与检测在解剖镜下取出5 尾样本鱼（剩余5 尾备用）的微耳石、星耳石、矢耳石（图1）后，进行耳石样本前处理，先在荧光显微镜（OLYMPUS BX51 型）下进行耳石ALC 标记检测，再检测同一耳石上Sr 的沉积标记状况。（1）耳石样本ALC 标记检测具体方法如下：将耳石清洗干净后，用透明指甲油封片，待凝固后在荧光显微镜下，分别用荧光显微镜的2 组滤光片（蓝色激发光WBS 和绿色激发光WGS）对耳石进行比较观察，拍照。耳石荧光标记强度参照欧阳斌等[6]的方法按无（-）、微弱（+）、较明显（++）、明显（+++）及非常明显（++++）5 个等级来记录。（2）耳石样本Sr 标记检测具体方法如下：耳石样本用环氧树脂（Epofix，Struers，丹麦）包埋固定，再使用 500 目和1 200 目砂纸打磨至接近核心截面，然后用磨抛机（LaboPol-35，Struers，丹麦）配合抛光液将其抛光至核心截面，且表面无明显划痕，清洗后晾干24 h，待完全干燥后，用真空镀膜机（JEE-420，日本电子株式会社）完成镀膜。参考邱晨等[7]的分析方法，利用电子探针微区分析仪（EPMA，JXA-8100，日本电子株式会社）对耳石样本进行元素微化学的定量线分析和面分布分析。

图1 鲤幼鱼的3 对耳石

1.3 数据处理

利用Excel 2007 软件进行统计分析并作图，对鲤幼鱼的死亡情况、体重和全长等数据进行差异显著分析（P＜0.05 为差异显著）。耳石不同区域Sr/Ca 比值用平均值±标准差表示。由于耳石中的Sr 含量远小于Ca 含量，所以按惯例Sr/Ca 指经过标准化的比值，即统一用（Sr/Ca）×103的比值表示，简称Sr/Ca 比值[7]。

2 结果与分析

2.1 复合标记处理对鲤幼鱼生存和生长的影响

在整个试验过程中标记组和对照组试验鱼均未出现死亡（表1），在恢复续养20 d 时，2 组试验鱼的平均全长和平均体重（n=5）均有增长，无明显差异（P＞0.05），且标记组试验鱼的活动行为、游动和摄食正常。从死亡率、行为学上来说，在该试验设计的剂量范围内，复合标记处理对标记鱼的急性和慢性毒性风险小，不会对试验鱼的活动行为、游动和摄食产生显著影响。

表1 鲤幼鱼耳石复合标记后恢复续养20 d时个体的死亡率、体重和全长情况

2.2 鲤幼鱼耳石复合标记的标记效果

利用荧光和Sr 同时对同一鲤幼鱼进行复合标记，其3 对耳石均得到了良好的荧光标记和Sr 标记图谱，在耳石边缘形成了清晰可识别的橙红色ALC 标记轮和红色Sr 标记区，标记成功率为100%（图2）。

图2 鲤幼鱼耳石复合标记检测图谱

不同耳石Sr/Ca 比值不同区域变化趋势如图3 所示，标记组的线分布结果与面分布显示的从耳石核心至边缘的截面变化一致，先是急剧升高，出现1 个明显的Sr/Ca 比值沉积高峰（Sr/Ca 比值远大于3.0，对应于面分布中耳石上红色Sr 标记区），后又逐渐下降并恢复至标记前正常水平（Sr/Ca 比值小于3.0，对应于面分布中耳石边缘蓝色区）。而对照组耳石Sr/Ca 比值较低，变化趋势平稳且无明显波动（Sr/Ca 比值小于3.0，面分布中整个耳石截面均表现为蓝色区）。这说明ALC-Sr 复合浸泡标记是有效的。

标记组的3 类耳石在绿色激发光、蓝色激发光下均可发现荧光标记信号（图2）。在绿色激发光、蓝色激发光下，虽然检测到的荧光标记环均为橘红色，但不同光源下ALC 标记环分辨度不同。在绿色激发光源下，标记环在耳石上呈深橘红色，耳石中心区（核心至标记环之间区域）及外围（标记后恢复续养期间耳石新生长部分）呈淡橘红色，与标记环的颜色相近，不易分辨、识别；在蓝色激发光源下，标记环在耳石上呈橘红色，耳石中心区（核心至标记环之间区域）及外围（标记后恢复续养期间耳石新生长部分）呈绿色，颜色差异显著，易于识别。通过对不同激发光下荧光效果的比较发现，在蓝色激发光下的ALC 标记环最明显。因此，在检测鲤幼鱼耳石上的ALC 标记环时使用蓝色激发光源应该更适宜且有效。

从耳石ALC 和Sr 标记图谱来看，矢耳石、微耳石和星耳石均可检测到荧光标记环，但不同耳石上的荧光和Sr 标记的强度不同。在蓝色激发光下，星耳石上ALC 标记环清晰、颜色鲜艳，非常明显（++++）。从恢复的情况来，星耳石ALC 标记恢复最快。因此，星耳石标记效果最好。

由图3 可知，从Sr/Ca 比值来看，微耳石Sr/Ca比值峰值为138.12±46.63，面分布图谱上表现的红色Sr 标记区宽而粗，易被观察，星耳石和矢耳石的Sr/Ca 比值峰值分别为15.96±3.31、26.61±2.27，红色Sr 标记区虽较窄，但已足够说明Sr 标记效果；从代谢Sr的速度来看，星耳石和矢耳石代谢Sr的速度更快，其边缘表现出的红色Sr 标记区之后已有明显的蓝色峰值恢复阶段，星耳石和矢耳石Sr/Ca 比值已恢复到标记前的正常水平，而微耳石边缘未恢复。

图3 标记组合处理组鲤幼鱼耳石从核心（0 μm）到边缘定量线分析的Sr/Ca 比值变化

3 讨 论

3.1 鲤幼鱼复合标记有效性评价

利用化学染料和微量元素短时间浸泡标记鱼类，必定会对其生理造成一定程度的胁迫，也可能会对鱼体的生存和生长产生一定毒性。周乔[8]的研究表明，在标记过程中鱼体虽在短时间内会因外界环境条件改变而遭受胁迫，产生应激反应，但一段时间后可以恢复正常。目前，关于这方面的研究报道较少。该研究利用200 mg/L ALC 和80 mg/L SrCl2·6H2O 同时浸泡标记鲤幼鱼，2 d 后试验鱼无死亡情况，表明在该研究设计的剂量范围内，标记物对试验鱼的急性致毒风险小。恢复续养期间标记组和对照组正常生长、生存，无死亡现象，在恢复续养20 d 时平均体重和平均全长也无显著差异。这表明利用这2 种物质同时浸泡标记鱼类，标记鱼对其的毒性反应不敏感，相对安全性较高。这与单一进行ALC 或Sr 标记其他鱼类得到的安全性结果一致[9-10]。

在过去的研究中，体外标记法、分子标记法等均在鲤鱼放流标记中普遍应用，但这些标记方法存在一定的局限性，均不适合鲤鱼早期个体规模化放流标记。课题组前期证实了利用化学物质标记鲤鱼早期个体是有效可行的，而该研究将ALC 和Sr 结合起来在同一时间对同一批次鲤幼鱼进行耳石复合标记，不仅获得了与单一ALC 或Sr 标记一致的效果[7,11]）和100%的标记率，而且2 种标记的检测互不干扰，结果可在2种设备（荧光显微镜和电子探针微区分析仪）中展示，不需要标记和相关风险之间的时间间隔。由于ALC和Sr 检测的耳石准备在第一步几乎是相同的，且在鱼类早期个体中，耳石荧光检测可直接用透明指甲油封片后（无需打磨耳石）放在荧光显微镜下观察，因此可先检测耳石上的荧光标记，这样既方便又省时省力。但若需检测较长时间前的标记鱼，当荧光衰败或荧光反应不明显时，可再通过Sr 标记确认即可，因为Sr 标记在耳石上能长久保存。这将大大缩短检测时间，节省检测成本，提高检测效率。

综合表明，利用荧光物质和Sr 进行复合标记是可行的，这与王臣[12]对大麻哈鱼（Oncorhynchus keta）先进行Sr 标记再进行ALC 标记得到的结果一致，在其他鱼上也有类似结果[13-14]。下一步课题组将探究关于荧光物质与Sr 在鱼耳石上的沉积速度及时滞性等问题，期望能够了解荧光标记与Sr 标记出现在耳石上的先后顺序，以便指导生产应用。

3.2 鲤幼鱼复合标记最适合耳石样本筛选

从该研究选择的3 对耳石的ALC 和Sr 标记图谱来看，矢耳石、微耳石和星耳石均可检测到ALC 标记环和Sr 标记区，但不同耳石上的ALC 和Sr 标记的强度不同。

在蓝色激发光下，星耳石上ALC 标记环清晰、颜色鲜艳，与鲤鱼耳石自身发出的荧光颜色对比非常明显；且从恢复续养过程的情况来，星耳石ALC 标记结束，耳石状况恢复正常的速度最快。因此，星耳石较为适宜作为观察ALC 标记效果的靶耳石。

对比3 对耳石的Sr 标记特征，从Sr 标记区宽窄来看，微耳石表现的红色Sr 标记区宽而粗，易被观察；而星耳石和矢耳石的红色Sr 标记区虽较窄，但已足够显示Sr 标记的明显效果。造成耳石间Sr 标记区宽窄的原因可能是：（1）由于耳石结构不同，微耳石和矢耳石的矿物相为文石晶体，而星耳石则为球文石晶体构成[15-16]，导致耳石吸收Sr 的量不同导致的，Macdonald 等[17]研究显示微耳石的Sr/Ca 比值比星耳石高7 倍左右，这与笔者的研究中微耳石峰值的Sr/Ca 比值比星耳石高8.6 倍的结果一致；（2）由于Sr在不同耳石上的时滞效应差异造成的[7,18]，从Sr 标记区耳石的恢复状况来看，星耳石和矢耳石边缘的红色Sr 标记区已有明显的Sr/Ca 比值回到标记前正常水平的蓝色区域，而微耳石边缘Sr 含量仍未恢复到正常状态。另外，从耳石样品采集和前处理的容易程度来看，微耳石形态很小，采样和前处理难度较大，而鲤科鱼类矢耳石形状特殊，呈细长的长条状，摘取和打磨时都易损坏。与之相比，星耳石最大，形状规则，易采取，便于前处理。因此，星耳石亦较为适宜作为观察Sr 标记效果的靶耳石。

4 结 论

该研究对鲤幼鱼进行了200 mg/L ALC 和80 mg/L SrCl2·6H2O 的复合标记，采集矢耳石、微耳石和星耳石这3 对耳石进行检测，结果均检测到了明显可识别的ALC 标记环和Sr 标记区，标记率为100%，证实荧光-Sr 复合标记模式是有效和可行的。不同耳石上的ALC 和Sr 标记强度不同，基于标记效果的显著性和标本前处理的便利性综合考虑，建议首选星耳石作为鲤幼鱼荧光-Sr 复合标记相关检测的靶样本。