狭果茶藨子营养成分分析与氨基酸提取工艺优化及评价

刘哲，叶英*，罗黎霞，王虹，张祎睿

1(青海大学 农牧学院，青海 西宁，810016)2(青海大学 化工学院，青海 西宁，810016)

狭果茶藨子(RibesstenocarpumMaxim)，又名长果醋栗，为虎耳草科茶藨子属，该属植物在世界约有160余种[1]，目前，我国在不同地方开展了茶藨属植物资源的调查[2]，其中以陕西、四川、新疆、青海等地分布较多[3]，大多生长在山坡灌丛、山地针叶林或溪旁。据相关资料记载，茶藨子的各个部位都具有一定的价值[4]，其果实浆汁饱满，富含营养成分，如维生素、粗纤维、蛋白质、黄酮类及氨基酸等[5]，具有降三高、保护心血管等生理功能[6]。茶藨子不仅风味独特、天然无污染，而且具有良好的加工性能，可用于功能性食品的开发，故又被称作第3代水果[7]。青藏高原茶藨子资源分布广泛，但大多处于野生状态，目前对其化学成分的研究尚处于起步阶段，且多集中于有机酸、黄酮、花青素以及生物碱等活性成分，关于氨基酸的研究鲜有报道。

氨基酸作为植物蛋白组成的基本物质单元，不仅影响着食品的风味与营养价值，同时能够提高人体免疫机制[8]。SADZUKA 等[9]通过药理试验发现，茶氨酸可以通过增加阿霉素的浓度，抑制肿瘤活性。HASE等[10]发现，酪氨酸能够明显改善思维记忆能力以及可能由身体或精神上的超负荷引起的情绪恶化，通过增加酪氨酸的摄入量来达到对心理及行为的有益影响。研究发现，茶藨子果实是良好的天然氨基酸植物源，能补充人体必需的氨基酸，因此有必要进一步研究其提取工艺及成分组成。近年来，有关天然产物氨基酸的提取方法较多，主要有加热回流法[11]、超声波法[12]、微波法[13]、超临界流体萃取法[14]等。其中超声波法是最常用的一种提取方法，依据超声过程中释放的机械作用破坏植物细胞壁和细胞膜，从而提高从天然产物中提取生物活性化合物的效率，该方法用时短、无需高温处理便能使活性成分高效率的溶出，从而达到系统性评价其成分组成的目的。

为了全面深入地探究青藏高原特色浆果资源狭果茶藨子的综合品质及食用价值，本试验对狭果茶藨子果实中粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、矿质元素及总糖含量进行测定，采用超声波辅助提取法结合响应面试验优化氨基酸提取工艺参数，并利用氨基酸分析仪对其成分组成进行分析，以期从营养学角度较系统地阐述狭果茶藨子的使用价值，同时也为该浆果资源功能性食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狭果茶藨子果实采自青海互助，采集地海拔3 029 m，经度101°50.926，纬度36°57.670。狭果茶藨子清洗后经实验室高能球磨仪处理成浆，4 ℃冰箱冷藏，备用。

Cu、Zn、Fe、Mn、Ca、Na、Mg、P、K、Se、Cd、Pb、Cr、V、Ge元素的1 000 μg/mL的标准溶液，国家标准品试剂中心；无水乙醇、KH2PO4、Na2HPO4、水合茚三酮、谷氨酸标准品为化学纯，天津化工有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-5200DB超声波清洗机，江苏昆山超声仪器有限公司；UV-1780紫外可见分光光度计，苏州岛津仪器有限公司；UBE-V0.2L实验室高能球磨仪，长沙德科仪器有限公司；K9840凯氏定氮仪，海能仪器股份有限公司；L-8900型氨基酸自动分析仪，日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 营养成分测定方法

参考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中索氏抽提法测定粗脂肪含量；参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定粗蛋白含量；参照GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》中高效液相色谱法测定总糖含量；参考GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》中化学分析法测定粗纤维含量；按照GB 5009.268—2016《食品中多元素的测定》中电感耦合等离子体-原子发射光谱法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)和电感耦合等离子体-质谱法(inductively coupled plasma-MS，ICP-MS)测定各元素含量。

1.3.2 狭果茶藨子氨基酸提取单因素试验

准确称取数份10 g狭果茶藨子鲜果浆液，以氨基酸提取量为评价指标，研究超声时间(10、20、30、40、50 min)、超声温度(25、35、45、55、65 ℃)、超声功率(200、250、300、350、400 W)、乙醇体积分数(30%、40%、50%、60%、70%)、液料比[25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1(mL∶g)]及提取次数(1、2、3、4、5次)对狭果茶藨子果实中游离氨基酸提取效果的影响。每组试验均平行测定3次。

1.3.3 Plackett-Burman(PB)试验设计

Plackett-Burman 设计是一种成熟且广泛使用的统计技术，通过忽略变量之间的相互作用，能够从多因素试验中选择具有高显著性水平的最有效因子以便进行更深一步优化[15]。在单因素试验的基础上，以游离氨基酸提取量为考察指标，选取超声时间(A)、超声功率(B)、乙醇体积分数(C)、液料比(D)、超声温度(E)、浸提次数(F)6个因素进行PB试验，试验设计如表1所示。

表1 PB试验因素与水平Table 1 PB test factors and levels

1.3.4 响应面试验设计

根据PB试验筛选得到对氨基酸提取量影响较大的3个因素，即超声时间(A)、乙醇体积分数(C)和超声温度(E)，以狭果茶藨子鲜果中氨基酸提取量为考察指标，通过Box-Behnken模型进行响应面试验，优化提取工艺参数。因素水平见表2。

表2 响应面设计试验因素与水平Table 2 Response surface design test factors and levels

1.3.5 狭果茶藨子氨基酸提取量的测定

在杨玲引等[16]方法的基础上，略有改动，测定样品中氨基酸质量分数。取5 mg/mL的谷氨酸标准品溶液 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL于试管，蒸馏水补至10 mL，移取上述溶液各2 mL于10 mL容量瓶，分别加入磷酸盐缓冲液2 mL，茚三酮溶液1 mL，摇匀，沸水浴20 min，冷却后定容，于566 nm处测定吸光度值，得到回归方程y=1.649 1x-0.011 6，R2=0.995 7。准确移取稀释到一定浓度的狭果茶藨子果实中游离氨基酸溶液2 mL，按上述标准曲线操作方法测定吸光度，按照回归方程计算狭果茶藨子中游离氨基酸提取量，如公式(1)所示：

(1)

式中：ρ，狭果茶藨子氨基酸质量浓度，mg/mL；V，提取液总体积，mL；n，稀释倍数；m，狭果茶藨子鲜果浆液的质量，g。

1.3.6 狭果茶藨子氨基酸的成分分析

将最优工艺参数得到的氨基酸提取液按照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》采用氨基酸自动检测仪测定成分组成。

1.4 数据处理

采用Origin 6.0软件对单因素结果进行处理；采用Design-Expert.V8.0.6软件对响应面进行模型构建。

2 结果与分析

2.1 狭果茶藨子果实中营养成分测定

狭果茶藨子鲜果中富含营养成分，其中蛋白质是人体必需的营养素，研究表明，植物蛋白含量较高的食物中的脂肪及胆固醇含量往往都很低, 同时含有大量膳食纤维, 正好与动物蛋白食物相反, 更有利于人的身体健康[17]。茶藨子果实中粗纤维含量为(24.4±0.61)%，蛋白质含量为(7.9±0.76)%，同时，糖也是人体所需能量的主要提供者，测得含量为(17.0±0.82)%，而粗脂肪含量很低，为(2.2±0.57)%，属于典型的低脂高纤维水果，是当代青年的瘦身食源。由表3可知，茶藨子果实含量较高的必需元素依次为K、Ca、P、Mg，其中K的含量高达9 770 μg/g，且K/Na将近280，体现了高钾低钠的特点，对于促进新陈代谢、调节血压、提高免疫等发挥着重要作用[18]。而微量元素摄入不足或过量均会影响机体正常功能。Zn、Fe、Ca、Mn这几种对人体有益的微量元素含量分别为27.8、215、2 970、6.24 μg/g，综合分析表明狭果茶藨子不仅具有酸甜爽口的浆果风味，而且营养保健价值颇高。

表3 狭果茶藨子果实中矿质元素含量 单位：μg/gTable 3 Mineral element content in R.stenocarpum fruit

2.2 单因素试验结果

2.2.1 超声波处理时间

由图1可知，狭果茶藨子鲜果氨基酸提取量随超声时间的增加而呈现先增加后减小的趋势，在30 min时达到峰值，这可能是由于在提取时间为30 min时，狭果茶藨子中的氨基酸已基本被提取出来，故氨基酸含量达到峰值，再延长超声时间，可能会造成氨基酸结构的改变，氨基酸含量反而下降，因此选取超声时间30 min为宜。

图1 超声时间对狭果茶藨子氨基酸提取量的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.2 超声波温度

由图2可知，狭果茶藨子氨基酸提取量随超声温度的增加呈现先增加后减小的趋势，45 ℃时游离氨基酸提取量达33.61 mg/g，这可能是因为较高的温度会导致扩散率增加，相应地使提取效率升高，此外，过高温度引起的氨基酸降解是导致提取率下降的重要原因。因此选取超声温度45 ℃为宜。

图2 超声温度对狭果茶藨子氨基酸提取量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.3 超声波功率

由图3可知，狭果茶藨子果实中氨基酸提取量随超声功率的增大而增加，在300 W时达到峰值，当超声功率不足300 W时，出现上升趋势。这可能是因为超声功率的增加，提高了热效应和空化作用之间的相互协调[19]，利于氨基酸的溶出。当超声功率>300 W，超声引起的空化效应得到抑制，从而降低了氨基酸的提取量，故选取超声功率300 W为宜。

图3 超声功率对狭果茶藨子氨基酸提取量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.4 乙醇体积分数

由图4可知，狭果茶藨子氨基酸提取量随乙醇体积分数的增大呈现先增加后减小的趋势，在40%时达到峰值，这可能是由于相似相溶原理，当乙醇体积分数与氨基酸极性接近时，氨基酸易于溶出，当增大乙醇体积分数后，其他醇溶性物质相继溶出，导致氨基酸提取量下降，因此选取乙醇体积分数40%为宜。

图4 乙醇体积分数对狭果茶藨子氨基酸提取量的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.5 液料比

由图5可知，随液料比的增加，狭果茶藨子氨基酸提取量呈现不断增加的趋势，在35∶1(mL∶g)时达到峰值，这可能是由于溶剂用量不足，氨基酸提取被限制，随着溶剂用量的加大，狭果茶藨子中氨基酸被充分提出，再增大用量，对提取量影响较小，且造成浪费。因此选取液料比35∶1(mL∶g)为宜。

图5 液料比对狭果茶藨子氨基酸提取量的影响Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.6 浸提次数

由图6可知，狭果茶藨子氨基酸提取量随浸提次数的增加而增加，浸提2次后氨基酸提取量达到峰值47.75 mg/g，随后基本趋于稳定。这可能是因为经过前2次的提取，氨基酸已经基本提取完全，继续增加浸提次数，对氨基酸提取量影响较小且耗时较久，因此选取2次为最佳浸提次数。

图6 浸提次数对狭果茶藨子氨基酸提取量的影响Fig.6 Effect of extraction times on the extraction amount of amino acids from R.stenocarpum

2.3 PB试验结果

PB试验的结果如表4和表5所示。模型P值为 0.016 1，呈显著性差异(P<0.05)，具有统计学意义。从各因素的P值可知，影响狭果茶藨子氨基酸提取量的主次因素为：乙醇体积分数>超声温度>超声时间>料液比>浸提次数>超声功率，其中超声时间和超声温度对狭果茶藨子氨基酸提取量的影响呈显著(P<0.05)差异，乙醇体积分数呈极显著差异(P<0.01)，其他因素差异均不显著(P>0.05)，因此，选择超声时间、乙醇体积分数和超声温度进行响应面试验。

表4 PB试验设计与结果Table 4 PB test design and results

表5 PB 试验结果分析Table 5 Analysis of PB test results

2.4 响应面优化试验结果

2.4.1 响应模型建立与分析

根据PB试验结果，按照表2进行响应面设计，结果见表6。通过Design-Expert软件展开二次多元回归拟合，获得狭果茶藨子氨基酸提取量与超声波时间、乙醇体积分数、超声温度的二次多项式回归方程：Y=47.57+0.12A-2.12C+0.77E+1.41AC-0.71AE-1.72CE-6.23A2-5.22C2-5.65E2。回归方程表明，影响狭果茶藨子游离氨基酸提取量的最大因素是乙醇体积分数，其次是超声温度、超声时间。

表6 响应面试验设计及结果Table 6 Response surface test design and results

表7 回归模型方差分析Table 7 Analysis of variance of regression model

2.4.2 响应面交互作用分析

通过3D拟合得到等高线图和响应面图，便于直观分析各因素之间交互作用的影响。如图7所示，试验考察3个因素中两两间所形成的曲面图均有一定坡度，其中超声时间与乙醇体积分数、乙醇体积分数与超声温度的曲面坡度较陡，等高线图呈椭圆形，说明超声时间与乙醇体积分数、乙醇体积分数与超声温度两两因素间呈现的交互作用均较明显，而超声时间与超声温度的等高线呈圆形，表明超声时间和超声温度对狭果茶藨子游离氨基酸提取量无显著影响。通过拟合得到狭果茶藨子游离氨基酸的最佳提取工艺为：超声时间30.4 min、液料比35∶1(mL∶g)、提取2次、超声温度54.8 ℃、超声功率300 W、乙醇体积分数40.2%，预测狭果茶藨子游离氨基酸提取量可达47.74 mg/g。

图7 两因素交互作用对狭果茶藨子氨基酸提取量的影响Fig.7 Effect of the interaction of two factors on the extraction of amino acids from R.stenocarpum

2.4.3 验证试验

为验证该响应面拟合得到的工艺条件是否准确，按此工艺条件进行3次提取，考虑到实际操作条件，将其修正为：超声时间30 min、液料比35∶1(mL∶g)、提取次数2、超声温度55 ℃、超声功率300 W、乙醇体积分数40%。狭果茶藨子游离氨基酸平均提取量达(47.57±0.67)mg/g，相对标准偏差为0.014 mg/g，与预测值相当，表明利用响应面法建立的回归模型可较好地预测狭果茶藨子中游离氨基酸的实际提取量。

2.5 狭果茶藨子氨基酸组成与评价

基于现代营养学理论，食物蛋白质氨基酸的种类、数量及组成比例决定着食物本身的营养价值，当氨基酸各组分越接近FAO/WHO模式要求，则该食物的营养价值越高，越有利于人体健康[20]。在FAO/WHO提出的理想蛋白质标准模式中, 当组成蛋白质的必需氨基酸/总氨基酸为0.4左右，必需氨基酸/非必需氨基酸为0.6以上时，表明该食品的营养价值较好[21]。本实验通过氨基酸自动分析仪测得狭果茶藨子中含有17种氨基酸，结果见表8，其中必需氨基酸总量为1.81 g/100 g，占总游离氨基酸的38.51%，基本符合理想蛋白质标准。在必需氨基酸中苯丙氨酸含量最高，达0.60 g/100 g，非必需氨基酸中谷氨酸含量最高，其次为天冬氨酸、组氨酸、丝氨酸等，这与孙晴等[5]的研究结果较为接近。谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，不仅能够提高免疫功能，而且具有调节大脑学习、记忆、认知等功能[22]。天冬氨酸是机体内重要的内源性氨基酸，在调节肠道微生物菌群及肝脏功能衰竭等方面发挥了重要的生物学效应。同时，谷氨酸和天冬氨酸也是重要的鲜味氨基酸，因此，从氨基酸角度分析狭果茶藨子果实具有极其重要的营养价值，可以用来开发成为具有特定功能性的食品。

表8 狭果茶藨子果实中氨基酸组成 单位：g/100 gTable 8 Amino acid composition in R.stenocarpum fruit

3 结论

研究发现，对于天然产物中氨基酸成分的提取，不同的提取方法对其含量具有很大的影响，这可能是由于方法的不同机制导致了氨基酸的未完全溶出或成分的损失。早期主要以传统的浸提法为主，随着科学研究的不断发展，逐渐演变出水浴回流法、微波消解提取法及超声提取法。较传统方法而言，这些方法都不同程度地提高了提取效率，优化了提取时间。但微波消解法由于其微波功率的不稳定性以及温度的不可控性，导致有效成分的结构破坏，而超声提取法通过自身产生的机械振动作用可以有效避免该不足。因此本研究采用超声波辅助提取法对青藏高原特色生物资源狭果茶藨子中氨基酸提取工艺进行优化，得到最佳工艺参数为：超声时间30 min、液料比35∶1(mL∶g)、提取次数为2次、超声温度55 ℃、超声功率300 W、乙醇体积分数40%。此条件下，得到的氨基酸平均提取量为(47.57±0.67)mg/g。通过对氨基酸组分进行分析，根据EAA/TAA和EAA/NEAA 比值, 狭果茶藨子中氨基酸基本满足FAO/WHO的理想模式，说明其富含人体必需氨基酸, 且组成合理均衡。

通过对狭果茶藨子果实中的营养成分进行测定，发现其果实中蕴含着丰富的对人体有益成分。与常规鲜果如蓝莓、桑葚、草莓相比[23-25]，狭果茶藨子果实中的膳食纤维及蛋白质含量均显著较高，同时脂肪含量偏低，是一种典型的低脂高纤维浆果资源。果实中富含K、Ca、P、Mg等多种有益元素,是补充机体所需矿质微量元素的天然食物来源，营养价值与使用价值较高。目前，对于狭果茶藨子的研究多集中在活性成分上，本试验填补了营养成分及氨基酸提取工艺参数和组分研究的空缺，为进一步开发与利用我国野生狭果茶藨子资源提供了重要的指导意义。