金黄色葡萄球菌肠毒素与耐药性分析

周建松 蒋家俊 简洁 刘小华 李婉宜

·基础论著·

金黄色葡萄球菌肠毒素与耐药性分析

周建松1*蒋家俊1简洁1△刘小华1李婉宜2

（1. 贵阳市疾病预防控制中心检验科，贵州 贵阳 550000；2. 四川大学华西基础医学与法医学院病原生物学系，四川 成都 610000）

检测2015年-2021年贵阳市食源性致病菌中的金黄色葡萄球菌肠毒素与耐药性，为有效防控贵阳市金黄色葡萄球菌食物中毒提供基础数据及参考。将2015年-2021年贵阳市收集并分离出的27株金黄色葡萄球菌采用微孔板酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）来检测肠毒素，并使用革兰阳性药敏板对27株金黄色葡萄球菌进行22种抗生素耐药检测。本研究发现27株金黄色葡萄球菌中有17株产生肠毒素，其中13株产肠毒素SEA，3株产肠毒素SEB，1株产肠毒素SED；药物敏感实验发现，24株金黄色葡萄球菌产生了耐药性并且为多重耐药，占总菌株的85.2%，青霉素与氨苄西林的耐药率最高，占85.2%。不产肠毒素的金黄色葡萄球菌株对四环素的耐药率高于产肠毒素的金黄色葡萄球菌（P＜0.01），而不产肠毒素的菌株及产肠毒素的菌株对其余抗菌药物的耐药率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。2015年-2021年贵阳市爆发的食源性疾病与食品安全风险监测中所分离出的金黄色葡萄球菌只有部分产生肠毒素，但是金黄色葡萄球菌的耐药率较高，多重耐药现象严重，耐药性与肠毒素的关系需进一步探究。

金黄色葡萄球菌；肠毒素；ELASA；耐药性

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus），又名金葡菌，属于葡萄球菌属，在自然界中广泛存在，是一种临床常见的条件致病菌[1]，是仅次于沙门氏菌和副溶性弧菌的第三大食源性致病菌[2]。

金黄色葡萄球菌可将食品作为繁殖的载体进行活动代谢，在适宜的基质和环境条件下产生金黄色葡萄球菌肠毒素，人类食用被金葡菌肠毒素污染的食品后会导致食物中毒[2]。目前研究已发现多种类型的肠毒素或类肠毒素，95%的金黄色葡萄球菌食物中毒是由肠毒素引起的，大多数金黄色葡萄球菌食物中毒是由肠毒素A-E引起[3-4]。此外，伴随金黄色葡萄球菌的耐药性不断增强，耐药金黄色葡萄球菌菌株不断增加，已经广泛引起了关注[5]。

在贵阳市细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒排前3位，是引起贵阳市食物中毒的主要细菌之一。故本研究拟对贵阳市2015年-2021年收集到的27株金黄色葡萄球菌进行了肠毒素检测及耐药性实验，以了解贵州市食源性金黄色葡萄球菌产肠毒素及耐药情况，为有效防控金黄色葡萄球菌食物中毒提供基础数据及参考，以进一步加强管理和防护，有效地预防、控制食源性疾病，亦为临床指导用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

27株金黄色葡萄球菌来源于2015年-2021年贵阳市爆发性食源性疾病与食品安全风险监测，金黄色葡萄球菌的阳性质控菌ATCC29213由贵阳市疾病预防控制中心保存。

1.1.2 试剂与仪器

VITEK 浊度仪（法国 BioMerieux）、全自动药敏实验菌液判读仪（美国赛默飞）、酶标仪（RT-6100）、RT-3100全自动洗板机（雷杜）。金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒（北京美正生物）、Baird-Parker 培养基（北京陆桥）、BHI肉汤培养基（北京陆桥）、GPALL1F（美国赛默飞）。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌的检测

本研究按照《食品微生物学检验-金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10-2016）进行分离、鉴定。分离纯化的金黄色葡萄球菌在革兰氏染色后在显微镜下呈现紫色葡萄球状菌落，血浆凝固酶试验阳性。

1.2.2 酶联免疫法检测金黄色葡萄球菌肠毒素

本实验参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10-2016）附录B和酶联免疫吸附法检测试剂盒说明书对分离到的菌株进行A、B、C、D、E型肠毒素检测。将27株金黄色葡萄球菌菌株使用BHI肉汤36℃隔夜增菌，使其最大程度地产生肠毒素。取2 mL 液体放入Eppendorf 管中，3500 g离心5 min，取上清液进行检测。

1.2.3 抗生素药物敏感性实验

参照CLSI指南推荐的微量肉汤稀释法，以金黄色葡萄球菌ATCC29213菌株作为本实验的阳性质控，检测17种抗生素对试验菌株的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。检测的抗生素包括氨苄西林（Ampicillin，AMP）、四环素（Tetracyclines，TET）、红霉素（Erythro-mycin，ERY）、氯霉素（Chloramphenicol，CHL）、庆大霉素（Gentamicin，GEN）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、利福平（Rifampin，RD）、左氟沙星（Levofloxacin Tablets，LVX）、链霉素（Streptomycin，STR）、克林霉素（Clindamycin，CLI）、利奈唑胺（Linezolid，LNZ）、莫西沙星（Moxifloxacin，MOX）、苯唑西林（Oxacillin，OXA）、氨曲南（Aztreonam，AZT）、头孢吡肟（Cefepime，FEP）头孢唑啉（Cefazolin Sodium，CZO）、青霉素（Penicillin，PEN）。

从原始的琼脂平板上挑取3-5个菌落，在无菌水中乳化培养，调节成0.5 McFarland浊度充分混合。取上述配置好的菌悬液10 µL加入含CAMHT肉汤培养基的11 mL试管中。用Sensititre一次性加样头替换试管盖，根据AIM®使用说明书对药敏板进行加样，将注入了含金黄色葡萄球菌的浓度适宜的菌悬液的药敏板放入35℃培养箱中培养18 h-24 h，用全自动药敏实验菌液判读仪判读结果，结果判读S敏感，I中介，R耐药。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计数资料以株数或率（n（%））表示，组间比较采用检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌肠毒素检测结果

27株金黄色葡萄球菌中有17株产生肠毒素，产毒率为63.0%。其中产肠毒素SEA有13株，产肠毒素SEB 3株，产肠毒素SED 1株。

2.2 药敏试验结果

27株菌株均对达托霉素、万古霉素、利奈唑胺、奎奴普汀/达福普丁、利福平、莫西沙星敏感，敏感率为 100% 。所有菌株对甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑、庆大霉素有较高敏感率，均为92.6%。对氯霉素（81.5%）、克林霉素（81.5%）、左氧氟沙星（81.5%）、环丙沙星（88.9%）、红霉素（77.8%）、苯唑西林较敏感（92.6%）；对氨苄西林、青霉素的耐药率均为85.2% ，其余依次是四环素55.6% ，红霉素22.2% ，克林霉素18.5% ，红霉素/克林霉素12.0% ，左氟沙星、环丙沙星均为11.1% ，苯唑西林、头孢西丁筛选均为7.4% ，氯霉素3.7% 。

本研究检测的菌株中，有23株呈多重耐药的现象，占85.2%，两重耐药的菌株占18.5%，三重耐药的菌株占33.3%，四重耐药的菌株占11.1%，五重及以上的菌株占22.2%。

不产肠毒素的金黄色葡萄球菌株对四环素耐药率高于产肠毒素的金黄色葡萄球菌（P＜0.05），而不产肠毒素的菌株及产肠毒素的菌株对其余抗菌药物的耐药率比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 肠毒素阴性菌及肠毒素阳性菌的多药耐药性比较

3 讨论

食品安全已经成为全世界关注的焦点问题，食源性致病菌造成的食品污染是导致食品安全问题的主要原因[6]。我国每年20%-25%的细菌性食物中毒事件是由金黄色葡萄球菌引起的[7]。金黄色葡萄球菌所致的食源性食物中毒主要由肠毒素引起的，肠毒素是一类结构相关、独立相似、抗原性不同的外毒素，一株金黄色葡萄球菌能分泌一型或两型以上的肠毒素[8]，且金黄色葡萄球菌所产生的肠毒素很稳定，不易被破坏，经 100℃ 30 min 仍然保持部分活性[9]，一般的烹调加热只能杀死金黄色葡萄球菌的菌体，不能灭活其肠毒素，被污染的食品在25℃-30℃环境下放置5～10 h，就能产生足以引起食物中毒的葡萄球菌肠毒素[10]，因此，一旦食品中产生了金黄色葡萄球菌肠毒素，就极易引发食源性疾病。近几年内，贵阳市发生了多次由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，并在每年食品安全风险监测工作中，不同种类的食品中致病菌检出金黄色葡萄球菌肠毒素阳性的比例仍较高，占约60.5%[11]。因此，由金黄色葡萄球菌引起的食物污染问题应受到监管部门重视。

金黄色葡萄球菌所引起的食物中毒往往是由金黄色葡萄球菌所产的肠毒素引起的，本次监测金黄色葡萄球菌，并做了肠毒素分型研究，对于研究并预防金黄色葡萄球菌的危害显得有很大的意义。在本次实验的27株菌株中，17株肠毒素基因检测阳性，检出率为63.0% ，与宋晓红等[12]山西省食品分离株产毒率63.85％研究结果相近。本次实验结果显示，所有阳性菌株中均只检出 1 种肠毒素基因，由表可知，sea 基因型肠毒素携带率最高, 这与某篇文献所报道的一致[13]。

近几年国内外研究表明，由于抗菌药物的不合理使用导致病原菌的耐药性越来越强[14]。临床上抗菌素的不合理及滥用现象非常普遍，不仅导致来自患者分离的金黄色葡萄球菌对耐药性的增长，特别是耐甲氧西林菌株的大量出现，而且因为养殖业中不规范的使用某些抗生素，也使食品类及外环境中分离的金黄色葡萄球菌的耐药性日益严重[15]。本研究从27株食源性金黄色葡萄球菌对22抗生素的耐药情况显示，对头孢西丁筛选、克林霉素、四环素、左氧氟沙星、氨苄西林、氯霉素、环丙沙星、红霉素、苯唑西林、青霉素10种抗生素产生不同程度耐药，其中对青霉素、氨苄西林的耐药达到85.2%，其次是四环素，耐药率达到55.6%，说明由金黄色葡萄球菌引起的耐药情况已非常普遍，同时也表明这3种药物已不适于金黄色葡萄球菌感染的治疗。而红霉素的耐药率为23.5%，明显低于章海通等[16]红霉素44.8%的耐药率。

不产肠毒素的金黄色葡萄球菌株对四环素的耐药比例高于产肠毒素的金黄色葡萄球菌，而不产肠毒素的菌株及产肠毒素的菌株对其余抗菌药物的耐药率比较差异无统计学意义。本研究样本数量较少，该对比结果需要更多的实验室数据进一步支撑。

实验结果发现，大多数的菌株都是多重耐药菌，多重耐药金黄色葡萄球菌的检出也就意味着食品方面将面临着更大的食品安全风险，也将成为严重的公共卫生问题，同时为临床给药和治疗带来更大的挑战。动物饲养过程中使用抗生素会导致食源性耐药菌的产生和扩散，且在食物中的药物残留可能干扰人肠道内的正常菌丛和诱导临床耐药病原菌株，而动物排泄物中的抗生素和耐药菌排入环境中可以长期保持耐药性质[17]。因此，各级食品安全监督管理部门应加强对食品市场的监管。同时，应该加大宣传力度，减少药物的滥用，谨慎添加动物饲料的抗菌药，防止细菌耐药性进一步加重。

1 周勇, 吴新伟, 胡玉山, 等. 2009-2018年广州市即食食品中金黄色葡萄球菌污染情况和菌型特征[J]. 中国食品卫生杂志, 2021, 33(4): 444-450.

2 杨庆文, 汤晓召, 杨祖顺, 等. 2010-2016年云南省食源性金黄色葡萄球菌肠毒素和mecA基因的检测及分析[J]. 实用预防医学, 2021, 28(6): 758-761.

3 林芳明, 张红见, 朱艳伟, 等. 西宁市食品中金黄色葡萄球菌污染状况及其肠毒素基因型分布研究[J]. 中国兽医杂志, 2018, 54(10): 101-105.

4 国译丹, 杨祖顺, 古文鹏, 等. 云南省食源性金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳分型分析[J]. 食品安全质量检测学报, 2017, 8(10): 3826-3830.

5 Smith DL, Harris AD, Johnson JA, et al. Animal antibiotic use has an early but important impact on the emergence of antibiotic resistance in human commensal bacteria[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(9): 6434-9.

6 Al-Kharousi ZS, Guizani N, Al-Sadi AM, et al. Hiding in fresh fruits and vegetables: opportunistic pathogens may cross geographical barriers[J]. Int J Microbiol, 2016, 2016: 4292417.

7 Paudyal N, Pan H, Liao X, et al. A meta-analysis of major food-borne pathogens in Chinese food commodities between 2006 and 2016[J]. Food-borne Pathog Dis, 2018, 15(4): 187-197.

8 张扬, 张兰荣, 周景林, 等. 2009-2011 年通州区食源性金黄色葡萄球菌的生物学及流行病学特征[J]. 中国微生态学杂志, 2013, 25(2): 214-217.

9 王秀茹. 预防医学微生物学及检验技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2002, 56.

10 王钊, 王克安. 中国疾病预防与控制指南[M]. 北京: 华夏出版社, 2000, 505-506.

11 周藜, 周倩, 朱玫. 贵州省食源性金黄色葡萄球菌肠毒素及耐药分析[J]. 中国卫生检验杂志, 2014, 24(22): 3318-3320.

12 宋晓红, 刘晔, 乔玫,等. 2010-2016年山西省九种食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的分布及耐药性分析[J]. 中国药物与临床, 2020, 20(09): 1421-1424.

13 Cho SH, Kim JH, Kim JC, et al. Surveillance of bacterial pathogens associated with acute diarrheal disease in the Republic of Korea during one year, 2003[J]. J Microbiol, 2006, 44(3): 327-335.

14 Decimo M, Silvetti T, Brasca M. Antibiotic resistance patterns of gram-negative psychrotrophic bacteria from bulk tank milk[J]. J Food Sci, 2016, 81(4): M944-51.

15 汪永禄, 张萍, 陶勇, 等. 不同来源金黄色葡萄球菌肠毒素及耐药性检测分析[J]. 实用预防医学, 2014, 21(04): 488-491.

16 章海通, 邢家溧, 傅晓, 等. 食源性金黄色葡萄球菌产肠毒素情况及耐药性分析[J]. 食品研究与开发, 2019, 40(20): 175-179.

17 徐勤, 巢国祥. 生牛奶中金黄色葡萄球菌污染状况及耐药性状研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(8): 972-973.

·PROGRESS·

Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan

Yi Zhou, et al.

Immature dentate granule cells (imGCs) arising from adult hippocampal neurogenesis contribute to plasticity and unique brain functions in rodents1,2 and are dysregulated in multiple human neurological disorders3-5. Little is known about the molecular characteristics of adult human hippocampal imGCs, and even their existence is under debate1,6-8. Here we performed single-nucleus RNA sequencing aided by a validated machine learning-based analytic approach to identify imGCs and quantify their abundance in the human hippocampus at different stages across the lifespan. We identified common molecular hallmarks of human imGCs across the lifespan and observed age-dependent transcriptional dynamics in human imGCs that suggest changes in cellular functionality, niche interactions and disease relevance, that differ from those in mice9. We also found a decreased number of imGCs with altered gene expression in Alzheimer's disease. Finally, we demonstrated the capacity for neurogenesis in the adult human hippocampus with the presence of rare dentate granule cell fate-specific proliferating neural progenitors and with cultured surgical specimens. Together, our findings suggest the presence of a substantial number of imGCs in the adult human hippocampus via low-frequency de novo generation and protracted maturation, and our study reveals their molecular properties across the lifespan and in Alzheimer's disease.

Nature . 2022 Jul 6. doi: 10.1038/s41586-022-04912-w.

Analysis of enterotoxins and drug resistance of Staphylococcus aureus

Zhou Jian-song1*, Jiang Jia-jun1, Jian Jie1△, Liu Xiao-hua1, Li Wan-yi2

(1. Laboratory Department, Guiyang Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550000, China; 2. Department of Pathogen Biology, West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610000, China)

To detect enterotoxin and drug resistance of foodborne Staphylococcus aureus in Guiyang from 2015 to 2021, so as to provide basic data and reference for effective prevention and control of Staphylococcus aureus food poisoning in Guiyang.Twenty seven strains of Staphylococcus aureus collected in Guiyang from 2015 to 2021 were tested for enterotoxin by microplate enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and 27 strains of Staphylococcus aureus were tested for 22 kinds of antibiotic resistance by gram-positive drug sensitive plate.In this study, 17 strains of 27 strains of Staphylococcus aureus producing enterotoxin, among them, 13 strains produced enterotoxins SEA, 3 strains produced enterotoxins SEB, and 1 strain produced enterotoxins SED. The drug susceptibility test found that 24 strains of Staphylococcus aureus developed drug resistance and multi-drug resistance, accounting for 85.2% of the total strains. The drug resistance rates of penicillin and ampicillin were the highest, accounting for 85.2%. The resistance rate of non-enterotoxin-producing Staphylococcus aureus to tetracycline was higher than that of enterotoxin-producing Staphylococcus aureus (P<0.01). There was no significant difference in the drug resistance rate (P>0.05).Staphylococcus aureus isolated from foodborne disease and food safety risk monitoring in Guiyang City from 2015 to 2021 only partially produced enterotoxins, but the drug resistance rate of Staphylococcus aureus was high and multi-drug resistant. The phenomenon is serious, and the relationship between drug resistance and enterotoxin needs to be further explored.

Staphylococcus aureus; Enterotoxin; ELISA; Drug resistance

周建松，男，主管技师，主要从事微生物检验，Email：85895275@qq.com；

简洁，女，主管技师，主要从事微生物检验，Email：jianjie10@163.com。

（2022-5-12）