利伐沙班联合Gsα基因沉默对心力衰竭大鼠心肌损伤的保护作用

魏长民 刘福珍 崔玉强

(胜利油田中心医院心血管内科，山东 东营 257000)

心力衰竭的发生与心肌炎症、凋亡等密切相关〔1〕。利伐沙班对心血管系统有保护作用〔2〕。利伐沙班对心力衰竭有治疗作用，治疗后患者心脏功能明显改善〔3〕。Gsα蛋白α亚单位(Gsα)蛋白可调控心功能〔4〕。干扰Gsα的心力衰竭幼鼠心功能指数改善，低表达Gsα可能具有改善心力衰竭的作用〔5〕。本研究拟分析利伐沙班联合Gsα基因沉默对心力衰竭大鼠心肌损伤的作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：雄性SD大鼠，SPF级，7周龄，体重220～260 g，由山东省实验动物中心提供，许可证号为：SYXK(鲁) 20190007。药品与试剂：兔抗B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)抗体由美国Abcam公司生产；TUNEL凋亡检测试剂盒由武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司生产；兔抗Bcl-2抗体由美国Santa Cruz Biotechnology公司生产；肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒由上海江莱生物科技有限公司生产；兔抗Toll样受体(TLR)4抗体由北京索莱宝科技有限公司生产；利伐沙班片，国药准字H20213305，规格：10 mg，批号：0021501由北京双鹭药业股份有限公司生产；兔抗核因子(NF)-κB p65抗体由碧云天生物技术研究所生产；白细胞介素(IL)-6检测试剂盒由上海传秋生物科技有限公司生产；shRNA control、Gsα shRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成。仪器MP160生理记录仪为美国 BIOPAC产品；XSP-3C显微镜为上海精密仪器仪表有限公司产品；SpectraMax i3x酶标仪为美谷分子仪器(上海)有限公司产品。

1.2模型构建〔6〕腹主动脉缩窄法构建心力衰竭模型，大鼠经过适应性饲养后，在手术前12 h禁止采食，10%水合氯醛麻醉，从剑突下1 cm处切口，用扩胸器撑开切口，取出盲肠，用无菌纱布将盲肠覆盖，分离腹主动脉，穿4号手术线，将7号针头在腹主动脉并行，结扎腹主动脉和7号针头，缓慢抽出针头，关闭腹腔并缝合切口。注射青霉素防止感染。大鼠手术后8 w，随机选择4只大鼠，检测左室舒张末期压(LVEDP)大于15 mmHg表示造模成功。另外选择12只大鼠，不结扎，其余同造模操作，记为对照组。

1.3分组给药 60只造模成功的大鼠分成模型组、sh-NC组、利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组、利伐沙班+sh-Gsα组，每组12只。造模成功后，sh-NC组、利伐沙班+sh-NC组在心包腔内注射100 μg shRNA control〔溶解在300 μl的磷酸盐缓冲液(PBS)内〕，sh-Gsα组、利伐沙班+sh-Gsα组在心包腔内注射100 μg Gsα shRNA (溶解在300 μl的PBS内)〔5〕。对照组、模型组注射等量的PBS。同时利伐沙班+sh-NC组、利伐沙班+sh-Gsα组灌胃20 mg/kg利伐沙班〔7〕。连续治疗4 w。最后1次给药后12 h，首先检测血流动力学，然后分离大鼠心肌组织，分别用于Western印迹、TUNEL、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。

1.4Western印迹〔8〕检测Gsα、Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κBp65蛋白表达 取0.1 g心肌组织，添加含有PMSF的裂解溶液，在冰上充分裂解，提取组织蛋白。在蛋白中添加2倍上样缓冲液，混合，在100℃煮沸5 min。配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。每个孔中上样30 μl蛋白样品，首先以90 V电压电泳至浓缩胶与分离胶的交界处时，以110 V电压继续电泳。以100 V电压转膜60 min。用5%脱脂奶粉封闭。将聚偏氟乙烯(PVDF)膜放在一抗内(除了NF-κB p65抗体以1∶1 000稀释，其余抗体均以1∶1 200稀释)，于4℃过夜。PVDF膜放在二抗(以1∶2 000稀释)内，在室温结合60 min。ECL发光，根据灰度值，β-actin作为参照，分析目的蛋白表达量。

1.5血流动力学指标检测〔9〕腹腔注射戊巴比妥钠，分离颈总动脉，将远心端结扎，在近心端切口，导管一端连接压力传感器，一端插入左心室，用生理信号采集系统检测LVEDP、左室收缩压期末压(LVESP)、左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.6TUNEL法检测细胞凋亡〔10〕心肌组织常规方法固定，石蜡切片。二甲苯浸泡2次，在100%、95%、90%、80%、70%乙醇中浸泡5 min。PBS洗涤。将切片放在蛋白酶K工作液中，37℃孵育15 min。置于封闭液内，室温封闭10 min。滴加TdT酶反应液，37℃避光反应60 min。滴加POD溶液，37℃避光反应60 min。滴加二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。二甲苯冲洗，封片。在显微镜下观察计数，TUNEL阳性所占全部细胞百分比为细胞凋亡指数。

1.7ELISA试验检测TNF-α、IL-6水平〔10〕取心肌组织，添加冰预冷的生理盐水，匀浆。以ELISA试验检测心肌组织中TNF-α、IL-6含量，步骤根据TNF-α检测试剂盒、IL-6检测试剂盒标准流程操作。

1.8统计学分析 利用SPSS25.0统计学软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组心肌组织中Gsα蛋白表达比较 对照组、模型组、sh-NC组、sh-Gsα组心肌组织中Gsα蛋白表达量分别为0.27±0.03、0.59±0.05、0.60±0.04、0.33±0.02，模型组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；sh-Gsα组蛋白表达量与sh-NC组差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组心肌组织中Gsα蛋白表达检测结果

2.2利伐沙班联合Gsα基因沉默对心力衰竭大鼠血流动力学的影响 模型组LVEDP、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax与对照组存在统计学意义(P<0.05)；利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组与sh-NC组上述指标差异有统计学意义(P<0.05)；利伐沙班+sh-Gsα组与利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组上述指标差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组血流动力学指标比较

2.3利伐沙班联合Gsα基因沉默对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响 模型组心肌细胞凋亡指数和Bax、Bcl-2表达量与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组与sh-NC组比较上述指标差异有统计学意义(P<0.05)；利伐沙班+sh-Gsα组与利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组比较上述指标差异有统计学意义(P<0.05)。见图2和表2。

1～6：对照组，模型组，sh-NC组，利伐沙班+sh-NC组，sh-Gsα组，利伐沙班+sh-Gsα组；同图3图2 各组心肌组织中凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达检测结果

表2 各组心肌细胞凋亡指数和凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达量比较

2.4利伐沙班联合Gsα基因沉默对心力衰竭大鼠心肌组织炎症因子TNF-α、IL-6的影响 对照组、模型组、sh-NC组、利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组、利伐沙班+sh-Gsα组心肌组织中TNF-α含量分别为(362.51±21.42)ng/L、(971.9±50.48)ng/L、(993.11±65.37)ng/L、(691.68±49.33)ng/L、(716.78±76.87)ng/L、(471.87±34.51)ng/L，IL-6含量分别为(87.52±7.88)ng/L、(290.49±23.15)ng/L、(281.04±24.54)ng/L、(198.38±9.52)ng/L、(184.74±16.98)ng/L、(122.48±10.04)ng/L，模型组TNF-α、IL-6含量与对照组差异有统计学意义(P<0.05)；利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组与sh-NC组比较上述指标差异有统计学意义(P<0.05)；利伐沙班+sh-Gsα组与利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组比较上述指标差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5利伐沙班联合Gsα基因沉默对心力衰竭大鼠心肌组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达的影响 对照组、模型组、sh-NC组、利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组、利伐沙班+sh-Gsα组心肌组织中TLR4蛋白表达量分别为0.25±0.02、0.75±0.08、0.74±0.07、0.58±0.06、0.53±0.08、0.34±0.04，NF-κB p65蛋白表达量分别为0.28±0.05、0.71±0.09、0.65±0.09、0.44±0.03、0.47±0.05、0.38±0.03，模型组TLR4、NF-κB p65蛋白表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组与sh-NC组比较上述指标差异有统计学意义(P<0.05)；利伐沙班+sh-Gsα组与利伐沙班+sh-NC组、sh-Gsα组比较上述指标差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 各组心肌组织中凋亡蛋白TLR4、NF-κB p65表达检测结果

3 讨 论

心力衰竭的发生与心肌细胞凋亡、心肌炎症等密切相关〔9,11〕。参与细胞凋亡的蛋白有多种，其中较为典型的是Bcl-2蛋白家族，Bax和Bcl-2分别为Bcl-2蛋白家族促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，二者表达变化与细胞凋亡密切相关〔12〕。TNF-α、IL-6均为炎症因子，可诱导炎症发生〔13〕。TNF-α、IL-6在心力衰竭过程中过度表达，且TNF-α、IL-6等炎症因子还可以进一步诱导心肌细胞凋亡，加快心肌损伤〔14〕。利伐沙班是抗凝血药，对心力衰竭有改善作用，利伐沙班可延缓心力衰竭进程〔2,15〕。Gsα可调控心脏β受体，干扰Gsα对心力衰竭幼鼠心功能有明显的改善作用〔5〕。本研究结果提示利伐沙班联合沉默Gsα可保护心力衰竭心肌损伤。

TLR4是Toll样受体家族，可激活NF-κB信号，诱导下游炎症因子活化，调控细胞增殖、凋亡〔16〕。NF-κB p65是NF-κB信号的关键亚单位，其表达增多，NF-κB信号激活水平增加〔17〕。TLR4/NF-κB在心力衰竭中过度激活，抑制其激活可减轻心力衰竭心肌损伤〔18〕。本研究结果说明，利伐沙班联合沉默Gsα降低心肌组织中TLR4、NF-κB p65蛋白表达量，利伐沙班联合沉默Gsα可能通过抑制TLR4/NF-κB信号减少心力衰竭心肌细胞凋亡和炎症因子，进而发挥心肌保护作用，这为心力衰竭的治疗提供了思路，为研究利伐沙班、沉默Gsα对心力衰竭分子作用机制奠定了基础。