猪伪狂犬病毒、经典型猪瘟、猪流行性腹泻病毒三重PCR检测方法的建立

王颖旺，陈燕凌，田志革，胡晓亮#

（1.宜宾市翠屏区农业农村局，四川宜宾 644000；2.宜宾市动物疫病预防控制中心，四川宜宾 644000；3.宜宾学院农林与食品工程学部/动物多样性与生态保育宜宾市重点实验室，四川宜宾 644000）

猪流行性腹泻病毒（PEDV）在小肠上皮细胞中几乎完全复制，导致绒毛萎缩、吸收不良和严重腹泻，引起传染性肠道疾病（呕吐、腹泻和脱水），造成猪严重的精神、食欲状况下降，引起仔猪的高死亡率，成年猪的生长缓慢，并且各种年龄的猪均易感染。2010年，由PEDV变种引起的PED大规模爆发在中国发生，造成了巨大的经济损失[1]。

伪狂犬病病毒（PRV）主要侵害猪的神经系统、呼吸系统和生殖系统，并且破坏猪的免疫系统，导致猪的多重感染，增加其死亡率。猪是PRV的天然宿主和重要感染源，可通过猪配种进行生殖系统感染，当妊娠母猪感染后，又通过胎盘进行垂直感染胎儿，严重会造成流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等。导致新生崽猪数量质量的下降，直接造成严重的经济损失。

经典猪瘟（CSFV）在临床中其发病率和病死率都在90%以上，猪是本病唯一的自然宿主，是高度传染性病毒性疾病，传染性强、死亡率高、是一种严重的跨界疾病，威胁着全球的生猪生产。分为以下几种疾病形式:急性、慢性和持续性病程。表现出高烧、厌食、胃肠症状、全身虚弱，结膜炎，不协调、瘫痪和抽搐，皮肤出血或发绀（如耳朵、四肢和腹部）。同时，病毒通过胎盘屏障，从而传染给胎儿，而被感染的小猪看起来很健康，在此期间，它们释放出足以传播的高病毒载量[7]。

在规模化养殖的猪场，2种或2种以上病毒共同感染的情况经常发生。仅凭借临床症状，很难断定疫病是由单一病毒还是由多种病毒所引起。传染性疫病传统的诊断较为费时；PCR方法较传统方法敏感，并已经用于多种猪病原的检测。但单一病毒特异的PCR方法，检测成本较高。因此，建立一种快速、又可信度高的检测方法，对病毒进行鉴定，将有利于疾病的准确诊断和疫病的流行病学监测。

本研究以3种重要猪源病毒病（PEDV、PRV、CSFV）为研究对象，通过条件优化建立特异性好、灵敏度高的3种病原三重PCR检测方法，为我国生猪市场猪病检测与管理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸

非洲猪瘟（ASFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、经典猪瘟（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）的核酸均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所汤艳东博士馈赠，病毒RNA经反转录获取的cDNA保存在动物多样性与生态保育宜宾市重点实验室。

1.2 主要试剂

Premix TaqDNA聚合酶购自Gen Star公司，DL2000 DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂粉、TAE缓冲液（50倍）、EB替代染料为国产分析纯。

1.3 引物设计及合成

在NCBI网站下载的PEDV、PRV、CSFV的基因序列，用DNA STAR的MegAlign程序对下载的基因序列进行比对，选择保守区，利用Oligo软件针对保守区各设计1对引物，引物序列及扩增目的片段的大小见表1。引物由成都擎科生物工程公司合成，使用时，用ddH2O将引物稀释至10μmol/L，置于-20℃冰箱保存。

表1 三重PCR引物信息

1.4 三重PCR检测方法的建立

以PEDV、PRV和CSFV的核酸混合物作为模板建立PCR反应，PCR反应体系采用50 μl，加25 μl Taq PCR Master Mix于体系中，PEDV、PRV和CSFV模板经适当稀释后（浓度分别为3.5 ng/μl，5 ng/μl，12 ng/μl）各 加1μL、PEDV、PRV和CSFV上下引物浓度（10 μmol/L ）各0.75 μl、最后加灭菌ddH2O补足50 μl。PCR反应程序：95℃预变5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。最后将扩增产物取5 μl于2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

1.5 三重PCR检测方法的条件优化

1.5.1 退火温度优化试验

采用50 μl的反应体系，进行退火温度优化。PCR的反应程序：95℃预变5 min；94℃变性30 s,梯度温度（50℃、52.5℃、54.5℃、56.2℃、57.3℃、60℃）退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。最后将扩增产物取5μL于2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，确定最佳退火温度。

1.5.2 引物浓度优化试验

根据优化的退火温度，进行引物浓度优化实验。设置0.1μmol/L、0.15μmol/L、0.2 μmol/L 3个引物浓度，PCR反应程序同1.5.1，最后将扩增产物取5 μl于2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，确定最佳引物浓度。

1.5.3 敏感性试验

根据已优化的反应条件，将PEDV（原始浓度为350 ng/μl）、PRV（原始浓度为1200 ng/μl）、CSFV(原始浓度为500 ng/μl)的模板进行10-1～10-10倍比稀释，各加1 μl于50 μl的体系中进行PCR反应，将扩增产物取5 μl于2%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，确定三重PCR检测方法的敏感性。

1.5.4 特异性试验

根据已优化的反应条件，在PCR反应体系中，加入PEDV、PRV、CSFV、上下引物（10 μmol/L）各0.75 μl，加入PEDV、PRV、CSFV、PRRSV、ASFV的模板各1 μl进行PCR扩增。最后将扩增产物取5 μl于2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，验证三重PCR检测方法的特异性。

2 结果与分析

2.1 三重PCR检测方法的建立

通过建立的三重PCR检测反应体系，对PEDV、PRV、CSFV的核酸模板及混合模板进行PCR扩增，结果分别获得了它们各自对应的条带，大小分别为518bp、401bp、213bp，与预期相符（见图1）。

2.2 退火温度的优化

采用不同的退火温度进行PCR扩增，由结果可知（见图2），退火温度为52.5℃时，效果较好。54.5℃、56.2℃、57.3℃、60℃；8.阴性对照。

2.3 引物浓度优化

采用不同浓度的引物进行PCR扩增，由结果可知（见图3～4）最佳引物浓度为0.15 μmol/L。

2.4 敏感性试验

将PEDV、PRV、CSFV核酸经10倍倍比稀释（PEDV原始浓度350 ng/μl；PRV原始浓度1200 ng/μl；CSFV原始浓度500 ng/μl）后作为模板，进行三重PCR反应，检测其敏感性。结果显示，该方法对PEDV、PRV、CSFV的最低检测限分别为3.5pg、12pg、0.05pg（见图5）。

2.5 特异性试验

用提取的PEDV、PRV、CSFV、PRRSV、ASFV的核酸作为模板，同时以ddH2O作为阴性对照，利用优化好的反应体系进行三重PCR检测方法的特异性实验。由图5可知，，建立的三重PCR方法对PEDV、PRV、CSFV的核酸能进行特异性扩增，对其他病毒核酸模板无扩增，表明该检测方法具有较强的特异性。

3 讨论

近年来，随着养殖业的不断发展，猪传染病对猪群健康有着极大的威胁，猪传染性疾病的多重感染或混合感染为主要流行形式，张森发现70.00%以上的病猪以病毒病为主并且80.00%以上的病猪均是由2种或2种以上的病原体混合感染，导致病猪临床症状表现复杂化[2]。因此，建立一种快速、高效、成本低的多重PCR检测方法非常有必要。

本试验建立关于PEDV、PRV和CSFV的三重PCR检测方法，敏感性、特异性结果表明，该方法具有良好的敏感性和特异性。

本研究建立的三重PCR检测方法，对PEDV、PRV、CSFV具有同时检测的效果，保持了单重PCR检测方法的准确性，又具有高效性和经济节约性，此方法可广泛应用其他地区的各养猪场传染病的检测，有良好应用前景。