基于DNA变异的中国汉族人群脱发表型推断及预测模型评估*

薛思瑶 李彩霞 贠克明 丛 斌 赵雯婷**

（1）山西医科大学法医学院，太原 030001；2）公安部物证鉴定中心，现场物证溯源技术国家工程实验室，法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038；3）河北医科大学法医学院，石家庄 050017）

脱发问题是近年来社会各界关注的热点问题，尤其在中青年人群中的发病率一直居高不下，对患者的心理、生活社交造成明显影响。人类最常见的脱发形式是男性型脱发（male pattern baldness，MPB），其特点是头皮上依赖雄激素的进行性脱发表现。MPB 严重程度与年龄、脱发部位等密切相关，发病率随年龄以平均每10 年提高10%的增速增长［1］，其在欧洲男性中的患病率很高，可达到80%［2］，而一项针对3 519 名上海男性脱发情况的研究显示脱发患病率在19.9%左右［3］。有多项研究表明，与高加索人相比，中国人、日本人和非裔美国人的患病率较低［4］。

人群遗传学研究显示，MPB 是一种高度遗传的多基因疾病［5］。早期针对双胞胎的研究表明［6］，MPB 的遗传力约为81%；Liu 等［7］基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）常见变异的分子遗传学方法估计MPB 的遗传力可达50%。近年来，随着基因分型技术和DNA 测序技术的快速发展，尤其是全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）的应用，MPB 的遗传学研究取得了突破性进展，欧洲人群GWAS 研究发现的MPB 显著关联SNP 位点已达1 000 个以上。比如，2017 年针对8 个独立的欧洲血统人群队列22 518 个样本的荟萃分析［8］确定了63 个MPB 显著关联位点（6 个位于X 染色体上，57个位于常染色体上），同时揭示了脱发不是孤立的特征，而是可与许多其他人类表型具有相关性的，例如前列腺癌和神经退行性疾病等。迄今人群规模最大的MPB 遗传分析来自2018 年Ⅴisscher等［9］对UK Biobank 205 327 个欧洲男性的研究，通过GWAS 关联出了624 个近独立的位点（598 个位于常染色体上，26个位于X染色体上）。同年一项针对7 万欧洲人群的GWAS 研究关联出了71 个独立遗传位点［10］，可解释总遗传力的38%。可见，MPB 虽然是多基因复杂表型，但与身高等表型相比，可以用相对较少的SNP 来解释较大比例的遗传力。因此，通过SNP 位点建立准确性较高的MPB遗传预测模型是可行的。

已有的MPB 遗传预测模型大多采用了逻辑回归算法。Hagenaars等［11］使用287个SNP位点建立多元逻辑回归模型，重度脱发的AUC（ROC 曲线下方的面积大小，area under curve）为0.78，但轻度脱发和中度脱发的AUC仅能达到0.68 和0.61。Liu 等［7］针对2 725 个德国和荷兰男性的研究尝试建立了25 个SNP 的逻辑回归模型，AUC=0.74。Marcińska等［12］使用305个50岁及以上的欧洲人群样本构建了20 个SNP 的模型，对脱发的遗传解释力为35%，AUC=0.86。

与欧洲人群MPB 的遗传预测研究相比，针对中国人群的研究报道相对较少。在本实验室的前期研究中，潘思宇等［13］针对中国的欧亚混合人群建立了两种MPB 预测模型，一种以年龄、BMⅠ和25个SNP为预测因子，AUC=0.82；另一种是以年龄、BMⅠ和68 个SNP 为预测因子，AUC=0.89。这两种预测模型虽然展现出良好性能，但在仅将年龄作为预测因子的情况下AUC值就可以达到0.77。可见该模型年龄依赖性过强，SNP的独立预测能力有待提高。

本研究选取了近十余年发表的关于MPB 研究的16 篇文献中486 个欧洲人群关联SNP 位点［7-8，10-12，14-24］，在312名中国汉族人群样本中进行关联验证分析，并基于筛选后的具有显著关联性的SNP位点建立了MPB逻辑回归预测模型，同时对k近邻分类器（k-nearest neighbor classifier）、随机森林（random forest）、支持向量机（support vector machine，SⅤM）等常见的分类器模型［25］在MPB遗传预测中的性能进行了比对评估，力求找到MPB预测准确性最高的建模方法。

1 材料与方法

1.1 男性型脱发表型的获取及分类标准

Hamilton-Norwood（H-N）脱发分级标准［1］根据发际线后移程度以及头顶部毛发稀疏程度将MPB划分为不脱发（Ⅰ类）、6种MPB主类型（ⅠⅠ至ⅤⅠⅠ类）和5 种亚类型（ⅠⅠA 至ⅤA 以及ⅠⅠⅠvertex）。参照该标准，本研究将表型分为两组（图1）：a.MPB 表型组，即头顶部可见明显脱发且发际线严重后移（Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ、Ⅴa、Ⅵ和Ⅶ）；b.对照表型组，即完全没有脱发或轻微发际线后移（Ⅰ和Ⅱ）。表型读取时，由3名评分者同时观看照片，并独立对每一位志愿者的MPB 等级进行评级，排除表型判断有困难的样本，以3个评分者对每个志愿者分级结果的众数作为最终的MPB等级。

1.2 样本及DNA提取

按照1.1的表型分组标准，本研究共收集了中国不同地域的汉族男性个体312 例，除7 例样本为南方汉族（四川6、江西1）外，其余均为北方汉族（山东4、山西296、河南5）群体，其中MPB表型组143 例，对照表型组169 例，且所有研究个体无内分泌功能障碍类疾病、未接受过毛发相关治疗。考虑到年龄因素对MPB的影响［12］，MPB表型组年龄在28～69岁之间，平均年龄约53，而对照表型组选取了高龄不脱发的志愿者，年龄在55 岁以上，平均年龄59 岁左右。详细组内信息和外观概览见表1 和图1。使用Canon EOS 5D Mark ⅠⅠ（佳能，日本）高清照相机分别采集志愿者头部左侧、正面及右侧3张二维照片。本研究通过公安部物证鉴定中心伦理委员会审查，所有参与者均签署了书面知情同意书。

1.3 基因分型及质量控制

使用Ⅰllumina HiSeq X Ten测序平台（Ⅰllumina，美国）对样本进行3X 低深度全基因组测序，每个样本得到平均10G Raw data。对经过变异检测（variant calling）处理后的数据，使用本实验室中国人群低深度测序2 510 份样本进行基因填补。使用PLⅠNK v1.9［26］对SNP进行质量控制，包括分型成功率（call rate）＞0.97，哈迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）P＞0.000 1和次等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞0.01。个体样本质量控制包括性别检查，亲缘关系检测及杂合性判断。以千人基因组数据第三阶段（1000 Genomes Project Phase 3）数据作为参考基因组，使用ⅠMPUTE［27］对常染色体进行基因填补并过滤填补质量分数小于0.6 的SNP，并再次重复上面质量控制标准，最终共获得20 681 872个SNP位点。

Table 1 Sample information

Fig.1 Diagram of MPB

1.4 统计分析

1.4.1 遗传关联分析

本研究选用基于欧洲人群关联出的486个SNP位点，均通过了质量控制，详细位点信息见附件表S1。使用Plink v1.9 软件（哈佛大学，波士顿，马萨诸塞州，美国） 分别进行了一般线性回归（general linear model，GLM）和二元逻辑回归分析，测试486 个SNP 与MPB 的相关性。基因型的赋值为加性模型，假设个体携带的次等位基因的数量与表型特征有累积效应。估计了所有SNP 的优势比（odds ratio，OR）、相应的95%可信区间（confidence interval，CⅠ）和P值。将P＜0.05 认为在关联分析中具有统计学意义。同时通过将所获得的OR与OR=1 时相比，从而估计脱发风险增加倍数。使用wANNOⅤAR［28］对与MPB 相关性最高的前20 个SNP 进行相关基因区域识别。多重假设检验校正后没有达到显著关联性的位点，故而在本研究中没有应用多重假设检验的校正。

1.4.2 预测建模

将在关联分析中具有统计学意义的SNP 位点作为建立预测模型的初始位点集合。首先对数据进行预处理，先将因变量的编码分为“1”（MPB 表型）和“0”（对照表型），再依据次要等位基因数目对SNP基因型进行编码：具有2个次要等位基因编码为“2”，只有1 个次要等位基因编码为“1”，不含次要等位基因编码为“0”。然后，采用两种方法对位点进行筛选，一种是基于R 软件STEP 函数对AⅠC信息标准进行逐步分析，另一种是通过R软件glmnet包建立Lasso回归模型，从而对SNP预测因子进行最终选择和排序。

逻辑回归适用于二值响应变量（即0和1），故选用二元逻辑回归对预测模型进行训练。模型假设因变量服从二项分布，模型的拟合形式为：

由于本研究样本量较小，采用十折交叉验证法来防止过度拟合。将MPB 的预测概率与观察到的MPB状态进行比较，将AUC作为预测准确性的总体衡量标准。AUC值的范围从0.5 到1.0，0.5 表示随机预测，1.0 表示完全准确的预测。如果预测概率＞0.5，则定义受试者为MPB，否则为不脱发。使用混淆矩阵比较预测和观察的脱发状态，并得出灵敏度和特异值，两者的范围都在0 到1 之间。所有候选SNP 分析和预测分析都在R v4.0.2（http://www.r-project.org/）中进行。

1.4.3 多模型对比评估

在R 软件中分别对k 近邻分类器、随机森林、支持向量机3 种机器学习算法进行建模-验证，获得不同模型的预测准确性从而对比模型的预测性能。建模过程中使用的R 包主要包括class 包、kknn 包、randomForest 包、e1027 包等。每种机器学习算法共运行10 次，求其平均值。对于二分类任务，可将验证样本的真实情况作为金标准，对所有验证样本的模型分类结果和金标准结果分别计数，从而获得分类器性能混淆矩阵。分别计算模型的正确率、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值以及五折交叉验证的预测准确性。以上分类器性能衡量标准的取值范围均为0～1，值越大，表示分类性能越高。

2 结果与分析

2.1 遗传关联分析结果

通过对312 个样本的486 个SNP 进行关联分析，发现174 个SNP 与MPB 显著相关，相关性最显著的20 个见表2。在与MPB 相关的SNP 中，位于chr20 上的位点最多，有145 个，chr5 和chr6 上各有6个SNP，chr1上有4个SNP，chr9和chr10上各 有3 个SNP，chr2 上 有2 个SNP，chr3、chr7、chr8、chr15、chr19 上各有1 个SNP。与前20 个显著位点有关的基因分别为EBF1、TFAP2C、PAX1以 及RUNX3。位 于EBF1 的rs17643057 在chr5 上的分布具有最高的统计学意义（逻辑回归关联分析OR=0.479，95%CI=0.321～0.714，P=3.42×10-4）。值得注意的是，当应用一般线性回归关联分析时，前9个SNP的显著性更高。据估计，携带rs985546-C等位基因的男性患MPB 的风险是携带T 等位基因男性的3.4 倍。从OR来看，其余3 个与MPB 易感性 相 关 最 显 著 的SNP 是rs17643057-G （chr5）、rs1422798-G（chr5）和rs6113382-A（Chr20），使MPB的风险分别增加2.1、2.0和1.9倍。

Table 2 Top 20 SNPs most significantly associated with MPB in Han Chinese （P＜0.05）

2.2 位点筛选

逐步回归不仅可以从备选因子中筛选出最终预测变量，还可以防止模型过度拟合。本研究通过双向逐步回归的方法，根据提前设定的赤池信息准则（Akaike information criterion，AⅠC），将直接纳入模型的174 个MPB 相关SNP 精简至22 个SNP 用于下游预测模型的建立。此时的AIC达到最小值，跨度区间为322.38～305.81（图2）。每一预测因子的方差膨胀系数（variance inflation factor，ⅤⅠF）均小于10，不存在多重共线性问题。

Lasso 回归基于惩罚系数λ对备选因子进行筛选，随着惩罚系数λ的增大，模型回归系数β逐渐趋近于0，最终变为0（图3a，b）。图3a 左侧虚线对应使模型估计误差最小的λ，右侧虚线对应使模型估计误差在可接受范围内的λ，根据最高效原则确定纳入模型的最优变量组合，最终筛选出25 个SNP位点。

Fig.2 Characteristic variable screening based on stepwise regression

Fig.3 Characteristic variable screening based on Lasso regression

2.3 预测模型

根据上述筛选得到的两种位点集合，建立了两个预测模型。两模型所包含位点信息见表3，详细位点信息见附件表S2。

第一个模型包括通过逐步回归分析筛选出的22 个SNP，该模型解释了患MPB 总风险的48%（R2=0.48）。第二个模型包括通过Lasso回归筛选出的25 个SNP，该模型解释了患MPB 总风险的45%（R2=0.45）。MPB 预测模型具有总体预测精度，区分度指标分别为AUC=0.85 和AUC=0.84，ROC 曲线见图4。应用50%的概率阈值，22-SNP 预测模型正确预测的总数为76%（236/309），有3 个不确定结果。然而，65%的概率阈值的正确预测降低到75%（234/311），有1 个不确定结果。同样，应用50%的概率阈值，25-SNP 预测模型正确预测的总数为74%（228/309），有3 个不确定结果。而65%的概率阈值的正确预测保持不变，仍为74%（226/307），有5个不确定结果。两模型均通过十折交叉验证的方法进行验证，验证后的AUC分别为0.81和0.77。在加入年龄作为预测因子之一后，预测准确性分别提升到了80%（251/312）和81%（252/312），没有不确定结果。相比较而言，通过Lasso回归筛选出来的位点在十折交叉验证过程中AUC有一定程度的下滑，且有个别位点存在多重共线性问题。22-SNP预测模型和25-SNP预测模型在18个SNP 上相同，仅存在4～7 个位点差异，但22-SNP预测模型在各项指标上均优于25-SNP 预测模型。在加入年龄作为预测因子后，两模型的预测准确率等各指标均有提升， 整体表现AUC均为0.89（表4）。

Table 3 Information of 22-and 25-SNP used in predictive model building

Fig.4 Receiver operating characteristic(ROC)curves for 22-SNP(left)and 25-SNP(right)MPB prediction models The ROC curves have sensitivity as the ordinate.

Table 4 Prediction performance for MPB with different SNP-sets and factors

2.4 分类器模型性能评估

通过混淆矩阵获得的分类器模型性能评价见表5。在3 种分类器模型中，最高的准确率是基于22-SNP 的支持向量机分类器模型，但也仅能到达68%，其预测效能和预测准确性远不如逻辑回归模型。

Table 5 Performance comparison of k-NN,random forest and SVM for MPB prediction

3 讨 论

本研究首次在中国汉族人群中进行较为系统的MPB 相关位点验证分析，并初步筛选出与中国人群MPB 表型相关的SNP 位点，同时构建出性能较高的非年龄依赖MPB预测模型。

从关联分析结果来看，chr20 上的多个SNP 与MPB具有强关联性，这说明chr20不仅是欧洲人群MPB的主要危险区域［29］，也是中国汉族人群MPB的主要危险区域，这提示了在不同祖源人群中MPB 可能存在相似的遗传机制。本研究中关联性最显著的SNP位点（rs17643057）所在基因区域已被欧洲研究证实与毛发生长特征有关［8］，受早期B细胞因子1（early B cell factor 1，EBF1）调控。EBF1 是早期B 细胞发育和脂肪形成所必需的转录因子，动物研究表明其在小鼠成熟、生长的毛囊中表达。除EBF1外，在本研究前20个显著关联位点中，有75% 以上位点与PAX1 （paired Box 1，PAX1）这一基因区域有关。PAX1在皮肤、头发和头皮中表达，是典型的MPB易感位点［17，29］。这提示了将PAX1 作为中国汉族人群MPB 候选基因的必要性。值得一提的是，本研究关联出的显著位点（rs2180439）在另一项基于中国汉族人群的研究中［14］同样被证实与脱发显著相关，效应方向与本研究一致，超过了统计意义的关联阈值（P≤3.13×10-3）。对于那些关联性较低的SNP，本文暂时无法验证SNP 是否与MPB 存在真实关联，需要进一步扩大样本量来提升结果的准确性。

为了进一步优化MPB 相关SNP 位点集合以建立预测模型，本研究采用了两种不同的位点筛选方法，并获得22-SNP和25-SNP两组位点集合。这样做的目的一方面是为了比较两种位点筛选办法所获得的SNP 对模型的预测性能所造成的差异，另一方面是为了防止模型过度拟合。若模型过度拟合，其在外部验证中的表现就会变差。在仅使用SNP作为预测因子的情况下，基于22-SNP和25-SNP脱发的二分类预测模型均表现出了良好的性能。在加入年龄作为预测因子后，模型的预测性虽有小幅提升，但不能排除在高龄对照样本的影响下，年龄所产生的虚假相关性。在实验室前期研究成果中，不加入年龄作为预测因子的前提下，模型AUC低于0.7［13］。说明本研究所采用的表型组、对照组样本筛选方法，显著降低了年龄对关联结果的影响，筛选出的位点对表型的影响效力更强，所解释的遗传力度相较前期研究的不足30%也有显著提升。

已有的MPB预测模型大多基于逻辑回归算法，本研究进一步探索了不同分类器模型对MPB 表型的预测性能。从逻辑回归、k近邻分类器、随机森林、SⅤM 这4 种常用分类器模型在本研究人群的运行结果来看，逻辑回归模型具有明显优势。

4 结 论

本研究通过将欧洲人群MPB 关联位点在中国人群的验证分析，为了解中国汉族人群MPB 的遗传机制奠定了基础。同时，所构建的预测模型，能够在不依赖年龄作为预测因子的条件下，达到较为优良的预测性能。在后续的研究工作中，通过扩大样本量、采用全基因组关联分析、引入表观遗传分析等方法，有望得到更优的MPB 相关遗传位点集合，建立更为精准的MPB 预测模型，应用到临床医学诊断和法庭科学领域中。

附件PⅠBB_20210329_S1.pdf 见本文网络版（http://www.pibb.ac.cn或http://www.cnki.net）。