兔子宫内膜上皮细胞α7-nAChR介导MAPK信号通路抑制炎性反应的机制

鲍朝霞，魏泓毓，陈 灰，曹金山，贺鹏飞，2*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018)

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)能够应答胞外和胞内刺激并介导细胞生长和分化、免疫反应、炎症以及肿瘤发生等多种生物学过程[1-3]。哺乳动物的MAPK家族主要包括3个亚族：细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase1/2,ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶1/2/3(C-Jun N-terminal kinases1/2/3,JNK1/2/3)、p38蛋白激酶(P38MAPki-nases,p38 MAPK)[4]。上皮细胞中，MAPK的活化与炎性细胞因子表达密切相关，因此在机体免疫反应中发挥重要作用。有研究表明，脂多糖(LPS)能够激活免疫细胞及上皮细胞的MAPK信号通路，上调MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平，并且随时间延长，其磷酸化水平呈动态变化。在奶牛乳腺上皮细胞中，LPS刺激0.5 h时，细胞ERK1/2、JNK、P38MAPK的磷酸化水平均显著升高，但是LPS处理1 h后，ERK1/2、JNK、P38MAPK的磷酸化水平呈下降趋势[5]。在奶牛子宫内膜上皮细胞中，LPS处理30 min内ERK1/2、JNK、P38MAPK的磷酸化水平呈上升趋势，但45 min 后开始下降，上述研究结果提示上皮细胞内存在一定的负反馈调节机制，以避免过度的炎性反应[6]。

“胆碱能抗炎通路”已被证实在神经抗炎机制发挥重要作用，α7烟碱乙酰胆碱受体(α7 Nicotinic acetylcholine receptors,α7-nAChR)是由同源的α7亚基组成的五聚体，通过调控细胞Ca2+通透性参与炎症反应，多种体内及体外炎症模型研究结果表明激活α7-nAChR具有抗炎作用，并且证明α7-nAChR在“胆碱能抗炎通路”中起核心作用。在免疫细胞和外缘细胞中，激活α7-nAChR可下调LPS诱导的ERK1/2、JNK、P38MAPK磷酸化水平，降低炎性介质的产生从而发挥抗炎作用[7]。

在LPS诱导的炎症反应中发现，上皮细胞存在避免过度炎性反应的负反馈调节机制，但这种细胞自我调控机制尚不明确。本研究通过比较兔子宫内膜上皮细胞α7-nAChR表达与MAPK信号通路相关性，初步探讨α7-nAChR是否介导细胞自我调控作用以避免过度炎症反应的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物雌性新西兰大白兔，体质量1.5～2.0 kg，购自北京斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物在温度18～26℃、湿度30%～50%条件下，自由饮食和进水，适应性喂养1周。

1.2 主要试剂孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)购自南京爱贝生物科技有限公司；青链霉素混合液、胶原酶Ⅰ、二甲基亚砜(DMSO)、D-PBS缓冲液、4×蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶试剂盒、20×PBST缓冲液、彩色蛋白预染Marker均购自北京索莱宝科技有限公司；0.25% 胰酶、DMEM/F12培养液、胎牛血清(FBS)、20×PBS缓冲液均购自Gibco公司；尼古丁(α7-nAChR激动剂)购自上海士锋生物科技有限公司； PNU282987(α7-nAChR激动剂)、甲基牛扁碱(α7-nAChR抑制剂，Methyl Mandeline,MLA)购自MCE生物公司；LPS购自Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒、M-PER细胞蛋白裂解液购自Thermo公司；蛋白酶抑制剂购自Pierce公司；牛血清白蛋白(BSA)购自BD Biosciences公司；Western抗体稀释液购自Biosharp公司；10×Tris/Glycine Buffer购自Bio-Rad公司；p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3、α7-nAChR抗体均购自Affinity Biosciences公司；p-P38MAPK、P38MAPK抗体购自Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体、羊抗鼠二抗购自三箭生物公司。

1.3 主要仪器超净工作台购自Airtech公司；超纯水仪购自Biotech公司；蛋白成像仪购自Generay公司；低速台式离心机购自安亭公司；CO2培养箱、低温高速离心机均购自Thermo公司；高压蒸汽灭菌锅、制冰机均购自Panasonic公司；电热恒温水槽购自上海森信实验仪器有限公司；电泳槽、恒压稳流电泳仪、半干式转膜仪均购自Bio-Rad公司；电子分析天平购自赛多利斯科学仪器有限公司；倒置显微镜购自OLYMPUS公司；电热鼓风干燥箱购自上海-恒科学仪器有限公司。

1.4 兔子宫内膜上皮细胞的分离培养新西兰大白兔肌肉注射PMSG 100 IU，48 h后耳缘静脉注射hCG 80 IU以调整不同个体生理周期一致，18 h后耳缘静脉注射空气栓塞处死。无菌采集兔子宫，用含有3%青链霉素的生理盐水反复冲洗3次，每次4℃静置10 min，直至冲洗液澄清。在超净台内用眼科剪将子宫纵向剖开，剪去多余组织，浸入含0.05% 胶原酶Ⅰ和0.05%胰蛋白酶的D-PBS中，37℃水浴消化30 min，之后使用含15% FBS的DMEM/F12培养基终止消化；培养基经100 目细胞筛过滤，滤液再使用400 目细胞筛过滤，滤网上为兔子宫内膜上皮细胞，使用DMEM/F12培养液反复冲洗细胞筛，冲洗液1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入D-PBS缓冲液重悬细胞，离心，重复3次；最后加入含15% FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞并接种于培养瓶，于37℃，5% CO2培养箱中培养。

1.5 分组与给药细胞经0.25%胰酶消化后接种于6孔板中培养，待细胞密度至85%～90%时，更换未添加血清及抗生素的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h，后更换为含15% FBS的DMEM/F12培养基。药物处理分组如下：PBS处理为空白对照组(第1组)、100 μg/L LPS处理组(第2组)、5 μmol/L MLA处理组(第3组)、100 μg/L LPS+5 μmol/L PNU282987处理组(第4组)、100 μg/L LPS+5 μmol/L PNU282987+5 μmol/L MLA处理组(第5组)、100 μg/L LPS+10 mg/L尼古丁处理组(第6组)、100 μg/L LPS+10 mg/L尼古丁+5 μmol/L MLA处理组(第7组)。

1.6 Western blot检测细胞经过药物处理12 h后用PBS清洗，加入适量的细胞裂解液提取总蛋白，用BCA法测定蛋白质浓度并调整蛋白浓度一致。每组分别取等量的蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，后将蛋白转移至PVDF膜上，3% BSA室温封闭2 h。分别加入稀释相应倍数的p-ERK1/2(1∶2 000)、ERK1/2(1∶5 000)、p-JNK1/2/3(1∶2 000)、JNK1/2/3(1∶800)、p-P38MAPK(1∶1 000)、P38MAPK(1∶1 000)、α7-nAChR(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)抗体，4℃过夜。TBST清洗3次，每次10 min。PVDF膜置入稀释羊抗鼠二抗(1∶7 500)、羊抗兔二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min。使用ECL Plus超敏发光剂显影、定影。以β-actin作为内参，通过Image J对比蛋白灰度值进行分析计算。

1.7 数据统计与分析试验数据采用SPSS 13.0软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析，使用GraphPad Prism 5.0软件制作数据图表，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 兔子宫内膜上皮细胞α7-nAChR的表达由图1可知，100 μg/L LPS、5 μmol/L MLA作用兔子宫内膜上皮细胞12 h之后，α7-nAChR表达明显高于对照组；相比于LPS组和MLA组，5 μmol/L PNU282987和10 mg/L尼古丁可明显降低α7-nAChR的表达，MLA可逆转PNU282987的效应，但其与尼古丁共同作用时，进一步降低α7-nAChR的表达。

1.CON组；2.LPS组；3.MLA组；4.LPS+PNU282987组；5.LPS+PNU282987+MLA组；6.LPS+尼古丁组；7.LPS+尼古丁+MLA组 *示P<0.05；**示P<0.01；***示P<0.001

2.2 兔子宫内膜上皮细胞α7-nAChR介导调控MAPK信号通路关键因子磷酸化由图2可知，100 μg/L LPS与5 μmol/L MLA处理兔子宫内膜上皮细胞12 h之后，相比于细胞空白对照组可明显降低JNK1/2及P38MAPK磷酸化水平，5 μmol/L PNU282987和10 mg/L尼古丁可明显抑制ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK 磷酸化水平，MLA可显著逆转PNU282987和尼古丁效应。

3 讨论

子宫内膜上皮细胞是子宫内膜抵抗病原微生物的第1道物理屏障，具有重要的免疫防御作用。大肠杆菌是引起子宫感染性疾病的重要致病菌，在感染子宫中会产生大量的内毒素，LPS是大肠杆菌的主要毒力因子[8-10]，低浓度的LPS便可以引起机体的炎症反应。机体免疫细胞及上皮细胞通过“模式识别受体”识别LPS并分泌炎性细胞因子以抵抗病原感染。但是过度的炎症反应会导致败血症、感染性休克或者全身炎症反应综合征。

MAPK信号转导通路是生物体内LPS诱导炎症反应重要的信号通路之一，由相关的丝/苏氨酸蛋白激酶组成，在哺乳类动物中有6种亚群，其中ERK1/2、JNK1/2/3、p38 MAPK主要参与机体的炎症及免疫反应[11]。当菌体释放内毒素后，LPS与LBP(LPS结合蛋白)结合形成LBP-LPS复合体，LBP将LPS运输到细胞膜并与膜上的CD14结合，激活细胞表面的TLR4。TLR4识别LPS后导致细胞内MyD88和TRIF信号通路的激活，最终引起MAPK信号通路的激活[12-15]。

LPS在短时间内引起MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平上升，并且随时间延长，其磷酸化水平呈动态变化。有研究表明，LPS快速激活奶牛子宫内膜上皮细胞和巨噬细胞的MAPK通路，p-ERK1/2、p-P38MAPK和p-JNK的表达量在30 min 时快速升高，之后磷酸化蛋白快速降解并开始受到抑制，表明细胞内存在一定的负反馈调节机制，以避免过度的炎性反应[9]。本研究发现，兔子宫内膜上皮细胞在100 μg/L LPS刺激12 h后ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK 磷酸化水平明显低于细胞空白对照组，说明兔子宫内膜上皮细胞存在细胞内负反馈调节机制，但这种细胞自我调控机制尚不明确[16-17]。

α7-nAChR在非中枢性炎症调节中具有重要作用，其介导JAK2/STAT3、NF-κB和MAPK等信号通路参与炎症反应调节。本研究主要目的是探讨兔子宫内膜上皮细胞α7-nAChR与细胞避免炎症过度反应的自我调控机制的相关性。结果表明，在作用12 h后，LPS可明显抑制ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK 磷酸化水平，α7-nAChR抑制剂MLA单独处理也可抑制ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK 磷酸化水平。有意思的是，α7-nAChR激动剂PNU282987和尼古丁分别与LPS共同处理细胞后ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK磷酸化水平显著低于与其相应的MLA处理组，且这种反应与α7-nAChR表达呈一定的负相关，上述结果初步说明LPS长时间刺激细胞后MAPKs磷酸化水平受到α7-nAChR调控，这种调控作用是细胞避免炎症过度反应自我调控的潜在机制。