绵羊肺炎支原体P113蛋白C末端基因真核表达载体的构建及其小鼠免疫应答

杨 鹏，吴 燕 ，岳 筠，陈 静，李 梅，王 慧，张双翔*，文 明,3，程振涛,3*

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008;3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)是引起绵羊及山羊发生支原体肺炎(MPSG)的主要病原，患病羊主要表现为消瘦、贫血、浆液性、纤维素性肺炎，严重时导致死亡，由于其高度接触传染性，给疫病的防控带来巨大挑战[1-4]。据资料显示，我国多个省份均有MPSG流行，且致病菌多为Mo，疫病的流行给养羊业带来严重的损失[5-8]。目前，关于MPSG疫苗研究主要集中在弱毒疫苗和灭活疫苗方向，弱毒疫苗存在着毒力增强和增加机体感染其他疾病等问题，在欧洲国家已经停止使用，在我国主要使用Mo灭活疫苗进行疫病的防控，而由于支原体体外培养困难，导致灭活疫苗成本较高，且存在灭活疫苗刺激机体免疫效果不佳和免疫保护时效短等问题[9]，因此，新型疫苗的研发则显得十分迫切和必要。

近年来，由于核酸疫苗刺激免疫应答能力强、安全、可靠、生产方便、免疫途径多样等优点因而受到越来越多的重视[10]，张友等[11]构建的羊口疮病毒F1L、B2L基因核酸疫苗能够很好的诱导小鼠体液免疫和细胞免疫应答，周怡等[12]将Mo TBP30基因和Hsp70基因融合构建重组质粒后，发现重组质粒能够增强小鼠细胞免疫和体液免疫功能；越来越多的研究资料表明核酸疫苗正处于当前的研究热点。近来随着贵州省养羊业规模的扩大，MPSG不断发生，科研小组从我省患病山羊成功分离几株Mo[13]，且通过对Mo贵州分离株P113基因进行生物信息学分析[14]，发现Mo P113蛋白C末端具有较强的免疫原性，本研究用已构建的pMD19T-P113质粒为模板，构建重组pVAX1-P113质粒并免疫试验小鼠，分析对重组质粒对小鼠免疫应答影响，以期为Mo基因工程疫苗的研制及疫病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞及实验动物Mo贵州株、pMD19T-P113、真核表达载体pVAX1、大肠杆菌感受态细胞DH5α、MDBK细胞(牛肾细胞)、Mo和Mmc羊源阳性/阴性血清、P113和LppA纯化蛋白由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室保存；4～5周龄BALB/c小鼠购自贵州医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂脂质体(Lipofecttamine TM3000)购自Invitrogen公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit 胶回收试剂盒、E.Z.N.A.TMPlasmid Kit 质粒提取试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒购自Omega公司；兔抗鼠IgG-HRP、兔抗羊IgG-HRP、兔抗羊IgG-FITC购自博奥森公司；限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ购自TaKaRa公司；小鼠白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)检测试剂盒购自上海巧伊生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 Mo P113基因重组质粒构建

1.3.1目的基因扩增及纯化 参考GenBank数据库Mo GZ-QX1株的P113基因序列(登录号：KR270152)，结合真核表达载体pVAX1多克隆位点，应用设计的特异性引物Mo-P113-P1/P2，选用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ作为酶切位点(下划线标识)，引物浓度10 μmol/L，预扩增片段696 bp，Mo-P113-P1：5′-AAGCTTATGCTCGAATCCAACGACGGAAGT-3′，Mo-P113-P2：5′-CTCGAGCTAGACAGTCCCTGCTGTTGTGG-3′；根据常规PCR方法，建立50 μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，Mo-P113-P1/P2各2.0 μL，DNA模板4.0 μL，ddH2O 17.0 μL。混合均匀后，按下列反应条件进行目的基因PCR扩增：94℃ 3 min；94℃ 45 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 10 min。取7 μL PCR产物应用含Gold View核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察目的基因扩增情况；经琼脂糖凝胶电泳检测后，参照E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit 胶回收试剂盒说明书进行目的基因胶回收。

1.3.2重组质粒pVAX1-P113构建 将纯化后的目的基因和载体分别运用限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ进行双酶切，回收酶切产物，将目的基因酶切回收产物与载体酶切回收产物运用T4连接酶16℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，接种于含Kan+(质量浓度为 50～100 mg/L)培养基上16～24 h后挑取单个菌落，进行PCR、双酶切及测序鉴定。

1.4 Mo P113 C末端蛋白表达鉴定取对数生长期的MDBK细胞，分别设置试验组、空白对照组、空载体对照组，参照脂质体(Lipofecttamine TM3000)使用说明将重组质粒的转染入MDBK细胞，于转染后48 h后运用RT-PCR方法检测目的基因转录情况，并用间接免疫荧光技术检测目的基因在细胞内的表达情况。

1.6 小鼠攻毒保护性试验取末次免疫14 d后各试验组小鼠5只进行攻毒，每只小鼠经气管途径感染对数生长期Mo菌液1 mL(1×108CCU/mL)，7 d 内观察小鼠的精神、食欲等症状作为判定发病标准，统计各试验组小鼠的发病情况和免疫保护率。

2 结果

2.1 重组质粒构建结果

2.1.1目的基因的扩增结果 以pMD19T-P113克隆质粒为模板扩增出P113基因，扩增产物电泳后可见约为696 bp的目的条带，与预测结果相符(图1)。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.Mo P113基因扩增产物；3.空白对照

2.1.2重组质粒筛选结果 以重组质粒为模板进行PCR鉴定及双酶切鉴定。重组质粒PCR扩增出现696 bp大小目的条带，而空白对照在相应位置没有目的条带(图2)；重组质粒双酶切呈现载体条带(2 999 bp)和目的条带(696 bp)，而空载体对照只有1条载体条带2 999 bp(图3)。并将PCR和双酶切鉴定均为阳性的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所获序列经过比对与预期相符。

M.DL2000 DNA Marker；1.空白对照；2.重组质粒

M.DL5000 DNA Marker；1.PCR对照；2.空载体对照；3.重组质粒

2.2 重组质粒在MDBK细胞中的表达结果

2.2.1目的基因在MDBK细胞转录检测结果 取脂质体转染的MDBK细胞提取基因组RNA，并将提取的RNA样本进行反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行目的基因转录情况检测，结果显示目的基因在细胞中RT-PCR扩增出现696 bp的目的条带，而空白对照和空载体对照在相应位置没有目的条带，说明目的基因能在MDBK细胞中转录(图4)。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.pVAX1-P113转染；3.pVAX1转染；4.空白对照

2.2.2P113 C末端蛋白表达结果 将重组质粒通过脂质体转染MDBK细胞，48 h后取细胞飞片，应用Mo阳性血清作为一抗采用IFA方法检测目的蛋白表达情况，结果见图5。重组质粒pVAX1-P113转染后的MDBK细胞出现特异性绿色荧光，而在pVAX1对照组和空白对照组中未观察到特异性荧光，说明重组质粒可在哺乳动物细胞内有效表达。

A..空白组；B.pVAX1转染；C.pVAX1-P113转染

2.3 重组质粒pVAX1-P113刺激免疫动物应答检测结果

2.3.1试验小鼠体液免疫应答检测结果 试验小鼠在免疫重组质粒后14 d内未发现任何临床异常现象。按照试验设计定时采集试验组小鼠血清，运用ELISA法通过1.5 μg/孔P113蛋白常温包被过夜、1%明胶封闭1 h、加入1∶100稀释的待检血清、二抗标记1 h、显色后用酶标仪检测样本D630 nm值。结果显示，免疫重组质粒后试验组小鼠血清中特异性抗体分泌量明显增多；自第1 周首免至第7 周时，重组质粒试验组小鼠血清特异性抗体D630 nm值均极显著高于Elution Buffer对照组和空载体对照组(P<0.01)，且第7 周时重组质粒试验组小鼠血清特异性抗体均为阳性，而重组质粒试验组中以重组质粒免疫剂量为100 μg时免疫效果最佳，提示重组质粒能够刺激机体体液免疫应答，且以剂量为100 μg 时免疫效果最好(图6)。

字母相同或ns表示差异不显著(P>0.05)，字母不相同表示差异极显著(P<0.01)；样本D630 nm值≥2.325时为阳性；样本D630 nm值<2.325时为阴性

字母相同或ns表示差异不显著(P>0.05)；小写字母不相同表示差异显著(P<0.05)；大写字母不相同表示差异极显著(P<0.01)

2.3.2试验小鼠细胞免疫应答检测结果 按试验设计定时采集试验组小鼠血清，应用细胞因子检测试剂盒检测IL-2、IL-4、IFN-γ的含量。结果显示，试验小鼠免疫重组质粒pVAX1-P113后，血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平显著上升，整体水平呈先升高，于第4 周到达顶峰后缓慢下降，且重组质粒pVAX1-P113试验组血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌量均高于Elution Buffer对照组和空载体对照组，同时分析发现重组质粒免疫剂量不同引起机体细胞因子分泌量也不同，重组质粒免疫剂量为100 μg时刺激细胞因子分泌量显著高于其他组；提示重组质粒pVAX1-P113能增强小鼠细胞免疫应答功能，且以剂量为100 μg时免疫效果最好(图7)。

2.4 小鼠攻毒保护性试验结果显示，各免疫组小鼠在人工感染Mo后，Elution Buffer对照组、空载体pVAX1对照组(100 μg)试验小鼠均出现发病症状；而重组质粒试验组小鼠发病数较Elution Buffer对照组和空载体pVAX1对照组少，且重组质粒pVAX1-P113(100 μg)组小鼠发病数最少，提示重组质粒对Mo感染具有一定的免疫保护作用，且以重组质粒pVAX1-P113(100 μg)组的保护效果为最佳，免疫保护率为4/5(表1)。

表1 小鼠攻毒保护试验结果

3 讨论

黏附素(adhesin)作为支原体的重要组成部分，通常为蛋白质或糖蛋白，与病原致病力具有相关性，对支原体在宿主细胞上定殖起着重要的作用[15-16]，广泛应用于致病机理、诊断防控研究和作为亚单位疫苗的候选蛋白。林裕胜等[17]基于Mo P80基因建立了PCR诊断方法；还有研究发现在猪肺炎支原体中为黏附蛋白的P97蛋白能够有效引起机体免疫应答，揭露了黏附蛋白作为疫苗蛋白的可能性[18]。P113蛋白是一种重要的黏附分子和膜表面免疫原，本研究小组通过分析Mo贵州株P113蛋白，发现其C末端具有极强的免疫原性，结果与国内报道研究发现黏附蛋白具有抗原性的结果相似[20-23]；因此本研究以pMD19T-P113质粒为模板，pVAX1为真核表达载体，构建了pVAX1-P113重组质粒。

IL-2、IL-4和IFN-γ是机体内主要的细胞因子，其分泌水平可作为检测机体细胞免疫应答的指标[24]，IL-2和IFN-γ属于典型的Th1型细胞因子，对增强机体细胞免疫反应和抗病毒感染有着重要作用；IL-4属于典型的Th2型细胞因子，主要作用为增强免疫系统的体液免疫反应[25-26]，本研究发现实验小鼠通过初免+加强免疫的方式后，血清中特异性抗体、IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平相较于空载体对照组和Elution Buffer对照组显著上升，TL-4分泌水平升高可提高机体免疫水平，IL-4增多可促进机体Th2向Th1分化，以保证Th1的持续分泌状态，从而增强机体细胞免疫的功能；IL-2和IFN-γ的分泌会使巨噬细胞活化及Th1的大量增殖，进而影响T细胞和巨噬细胞的分泌，以达到提高机体免疫能力[27]。分析发现特异性抗体和细胞因子整体水平呈先升高后降低，这与林伯全等[28]研究发现SPF鸡在感染鸡毒支原体F弱毒株后在28 d内其血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌量先升高后降低的结果相似，提示重组质粒可刺激机体体液免疫应答和细胞免疫应答。在重组质粒不同剂量对比中发现重组质粒剂量为100 μg时，刺激机体应答效果高于50，150 μg；对免疫组小鼠进行攻毒后发现，重组质粒不同滚剂量组均对小鼠存在免疫保护力，以重组质粒剂量100 μg时保护效果最好；提示P113 C末端蛋白可作为新型疫苗研发的候选蛋白，为Mo基因工程疫苗的研制提供参考依据。