超市零售鸡肉粪肠球菌耐药性及毒力因子流行分布特征

章 婧,陈海欣,喻梦梦,高颖茵,刘文字,蒋红霞

(华南农业大学 兽医学院 国家兽医微生物耐药性风险评估实验室/广东省兽药研制与安全评价重点实验室，广东 广州 510642)

肠球菌(Enterococcus)为革兰阳性菌，广泛分布于自然环境(如土壤、水和植物)中，也是人和动物胃肠道内常见的共生菌[1]。由于其参与宿主多项生理功能，因此被认为是对人类无害的共栖菌。但当机体的免疫环境遭到抑制或破坏时，肠球菌则会引起感染，通常包括伤口、尿道、腹腔、血流和外科手术感染[2]。目前，肠球菌是院内感染的重要病原菌。由于肠球菌具有固有耐药特征，并且具有获得耐药性和毒力因子及形成生物被膜的能力和倾向[3-4]，因此给临床治疗带来困难和挑战。随着抗生素在养殖业的大量、长期使用，导致动物源细菌耐药性快速增长。而抗生素耐药性可随动物肠道细菌传播给人类的潜在风险，已经成为全球关注的食品安全和公共卫生问题[5]。

肠球菌具有天然的将耐药性及毒力因子以水平转移方式传播给其他细菌的能力，因此养殖场长期使用抗生素选择出耐药肠球菌，成为了人类耐药条件致病菌的储库。有研究表明，肠球菌自身分泌的毒力因子与其致病力的有关，包括胶原蛋白黏附素(ace)、溶血素(cly)、心内膜炎抗原(efaA)、表面蛋白(esp)、明胶酶E(gelE)、聚集物质(asal)、透明质酸(hyl)等[6-7]。

加强养殖场动物肠道共生菌抗生素耐药监测对遏制耐药菌/耐药基因传播具有重要意义。泛欧盟一项长期(2004—2014年)的食品动物中抗生素敏感性监测项目(EASSA)，监测从屠宰的健康食品动物(肉鸡、屠宰猪和肉牛)中分离的人畜共患病原(沙门菌和弯曲杆菌)和共生菌(大肠杆菌和肠球菌)的抗生素敏感性表明，健康食品动物中肠球菌耐药性风险较低，对医学临床上至关重要的抗生素仍然敏感或者低水平耐药[8]。食品安全问题目前越来越受到人们的重视，其关系到消费者的生命健康。而生鲜肉类产品较易污染致病菌，其引起的食源性疾病是食品安全最主要的危险因素之一[9]。而目前我国食品源肠球菌抗生素耐药性相关研究报道较少，尤其对医学临床重要抗生素的耐药水平、传播扩散风险尚不清楚。因此，本试验采集了国内惠州、肇庆、郑州、天津4个城市不同超市的鸡肉样品，以具有重要公共卫生意义的粪肠球菌为对象，分析超市零售鸡肉源肠球菌耐药现状、耐药基因和毒力基因的流行分布，研究结果为细菌耐药性监控提供数据，也为评估由此带来的食品安全和公共卫生风险提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株2020年9-10月从惠州、肇庆、郑州、天津4个城市的超市鸡肉样品中分离到41株粪肠球菌，质控菌ATCC29212、MALDI-TOF-MS 菌种鉴定标定菌株大肠杆菌8739保存于华南农业大学药理教研室。

1.2 主要试剂和仪器MH固体培养基、MH液体培养基、BHI固体培养基、BHI液体培养基、叠氮钠-结晶紫-七叶苷固体培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司；2×HieffPCR Master Mix购自翌圣生物科技(上海)有限公司；微生物质谱鉴定仪MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪)购自岛津公司。

1.3 菌株的分离鉴定2020年9-10月间，采集了惠州、肇庆、郑州、天津4个不同城市的超市鸡肉样品96份，样品置于冰盒，于24 h内送至实验室进行肠球菌的分离和鉴定：鸡肉样品在6.5% NaCl高盐BHI肉汤中，37℃过夜增菌，划线接种于叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂平板。37℃培养18～24 h后，观察其菌落形态及培养基颜色，在培养基上大小中等、表面光滑，且能使周围培养基变黑的典型菌落，可初步判断为肠球菌。采用PCR方法对菌株进行分子鉴定：扩增粪肠球菌特异性持家基因[10]。PCR反应体系为25 μL，反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃终延伸5 min。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。采用微生物质谱鉴定仪MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪)对PCR扩增阳性的粪肠球菌进行鉴定。

1.4 药物敏感性试验按照2018年美国临床实验室标准委员会(CLSI)推荐的抗菌药物敏感性实验执行标准，对分离出的粪肠球菌进行氨苄西林(AMP)、左氧氟沙星(LVX)、环丙沙星(CIP)、四环素(TET)、多西环素(DOX)、替加环素(TGC)、万古霉素(VAN)、利奈唑胺(LZD)、利福平(RFP)、红霉素(ERY)、氯霉素(CHL)、氟苯尼考(FFC)等8大类12种药物的最小抑菌浓度(MIC)测定。同时本试验也对分离株进行了高水平氨基糖苷类耐药(HLAR)、高水平链霉素耐药(HLSR)检测。抗生素敏感性结果依据CLSI的耐药折点来判断。

1.5 耐药基因的检测采用PCR方法检测噁唑烷酮类(poxtA、optrA和cfr)、四环素类(tet(M)和tet(L))、氯霉素类(fexA、fexB和floR)、大环内酯类 (ermB)、喹诺酮类(qnrA、qnrB、qnrS)、糖肽类(vanA和vanB)等抗生素耐药基因，引物设计与退火温度参照文献[11]，扩增体系同1.3。扩增后的产物通过凝胶电泳进行检测，阳性产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行Blast分析。

1.6 毒力基因的检测对携带重要抗生素耐药基因optrA、cfr的肠球菌株，参照文献[12]，采用PCR方法，对ace、cylA、cylB、cylM、efaA、esp、gelE、asal、hyl和agg等10种常见的毒力基因进行筛查。扩增体系同1.3。

1.7 统计学分析应用 SPSS 22.0 软件进行数据分析，组间比较采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义，其中0.05

2 结果

2.1 细菌的分离鉴定通过实验室初步纯化培养，从形态上分离鉴定的疑似菌株进行PCR以及MALDI-TOF-MS鉴定。从采集的96份鸡肉源样品中，共分离鉴定出41株粪肠球菌，其中来自郑州的样品，分离到10株粪肠球菌；肇庆样品中，分离出14株；惠州和天津样品中分别得到10株和7株粪肠球菌(表1)。

表1 2020年不同地区超市样品粪肠球菌分离结果

2.2 药敏试验结果分析41株粪肠球菌的药敏试验结果显示，所有菌株均对AMP、VAN、LZD敏感，对LVX、CIP也很敏感，而对TET、DOX的耐药率最高均达到75%以上；对ERY和HLAR的耐药率分别为43.90%和41.46%。此外，菌株对RFP、CHL、FFC、HLSR的耐药率在20%～37%之间，相对较低(表2)。有48.78%的菌株呈现多重耐药表型(即对3类或3类以上的抗菌药物耐药)。

如表2所示，比较分离自不同地区超市鸡肉的粪肠球菌，分离自天津样品的菌株的耐药率除对喹诺酮类药物外，均低于其余3个地区的分离株，但均无统计学差异。但值得注意的是，在郑州的分离株中检测到1株TGC耐药菌株。

表2 41株粪肠球菌对抗菌药物的耐药率 %

2.3 耐药基因检测结果耐药基因检测结果显示，tetL最流行，检出率为51.22%。其次为ermB，检出率48.78%。optrA的检出率为41.46%；34.15%的菌株携带fexA；tetM基因的检出率最低，为7.32%。poxtA、fexB、cfr、floR、qnrA、qnrB、qnrS、vanA、vanB等基因均未检出。携带optrA基因的菌株往往携带多重耐药基因(15/17)。

比较不同样品来源粪肠球菌中耐药基因的流行分布发现(图1)，分离自广东惠州的粪肠球菌的耐药基因更复杂，检测到的耐药基因种类、检出率大多高于其余地区。这4个地区粪肠球菌所携带的耐药基因组合均以optrA-tet(L)-fexA-ermB最为常见。

*表明差异显著(0.01≤P≤0.05)

2.4 毒力基因检测结果分析对分离到的41株粪肠球菌进行毒力基因筛查，被检的10种毒力基因中检测出9种，其中efaA的检出率最高，达到95.12%(39/41)；其他依次为gelE73.17%(30/41)、agg58.54%(24/41)、asal36.59%(15/41)、ace34.15%(14/41)、cylA9.76%(4/41)。毒力基因cylB仅在1株广州肇庆分离株中检出。

检测的肠球菌往往携带多种毒力基因，36.59%(15/41)菌株携带0～2种毒力基因，56.10%(23/41)的菌株携带3～5种毒力基因，有1株来自广东肇庆的分离株同时携带8种毒力基因 (cylA、cylB、cylM、efaA、gelE、esp、agg、asal)。菌株携带的多个毒力基因以efaA-gelE-agg-asal组合最为常见。未检测到hyl毒力基因。

不同地区来源的肠球菌，携带的毒力基因也有差异。结果显示，除ace、asal外，广州肇庆地区粪肠球菌中各毒力基因种类的检出率均最高(图2)。天津地区粪肠球菌ace的检出率(71.43%)明显高于广东肇庆分离株(7.14%)(P<0.01)。广东肇庆地区粪肠球菌gelE的检出率(92.86%)明显高于天津分离株(57.14%)，agg的检出率(78.57%)明显高于广东惠州分离株(20.00%)(P<0.05)。不同地区携带的毒力基因种类也不相同，广东惠州地区以携带2种毒力基因的较多，以efaA-gelE最常见，在广东肇庆地区携带3种毒力基因的较多，以efaA-gelE-agg为主，而在郑州以及天津地区则以携带4种毒力基因的最多见。

两组之间标记字母相同，表示两组之间不存在差异；两组之间标记字母不同，表示两组之间存在差异

2.5 粪肠球菌携带毒力基因数与耐药性的关系粪肠球菌对抗菌药物敏感性和毒力基因之间的关系见表3。粪肠球菌携带毒力基因数≤2种的肠球菌共有15株(36.59%)，携带毒力基因数3～5种的有23株(56.10%)，毒力基因数≥6的有3株(7.32%)。但这三类菌株对CIP、DOX、RFP、ERY、FFC、HLGR、HLSR的耐药率之间无明显差异(P>0.05)，推测粪肠球菌携带的毒力基因数与耐药性无关联。

表3 携带不同毒力基因数目的肠球菌对抗菌药物耐药率

3 讨论

由于临床和畜牧养殖过程中大量使用抗菌药物，使耐药菌和耐药基因普遍存在于人类、动物及整个生态环境微生物中。基于“one health”理念下，人类、动物和环境形成紧密关联的整体，耐药细菌及耐药基因能在这个整体环境中不断转移、进化和传播。欧洲开展的抗生素耐药性监测数据表明，无论是医院还是社区获得性感染的耐药性调查均显示临床一些重要抗生素耐药性都在增加，如2011-2012年间，医院侵袭性金黄色葡萄球菌中甲氧西林耐药率为41%，肠球菌中VAN耐药率为10%，肠杆菌中第3代头孢菌素耐药率为33%，鲍曼不动杆菌中碳青霉烯耐药率高达81%。而过去10年中动物和食物链中发现的抗生素耐药性预示着人类抗生素耐药性将进一步增加。因此加强食品动物源细菌耐药性监测，对保障食品安全和公共卫生安全都具有重要意义。

本研究对不同地区超市鸡肉源粪肠球菌调查研究表明，不同地区粪肠球菌的分布、耐药性、耐药基因和毒力基因分布均存在差异。4个不同地区的超市鸡肉样品中，共分离到粪肠球菌41株，分离率为42.71%。李金磊等[13]研究表明，在180份规模化养殖场鸡源样品中分离粪肠球菌100株。可以推测，在养殖过程中流行的粪肠球菌可能是超市零售鸡肉粪肠球菌的重要来源之一。为了防止鸡携带的粪肠球菌污染鸡肉，导致影响食品安全的事件发生，在鸡养殖过程中应加强粪便处理及测样环境的清洁卫生，避免粪肠球菌在养殖场内大范围的传播。

近年来，随着肠球菌对抗生素耐药性的逐渐上升，出现了万古霉素耐药肠球菌(VRE)，利奈唑胺耐药肠球菌(LRE)、HLAR肠球菌，给兽医及人医临床治疗带来困难。对超市鸡肉样品中分离的41株粪肠球菌进行药敏试验，结果表明鸡肉粪肠球菌存在一定的耐药性。除喹诺酮类药物外，各地区分离株对不同药物的耐药率基本呈现出广东惠州地区最高，河南郑州地区次之，天津地区最低的趋势，且对3类或3类以上抗菌药物耐药的多重耐药菌株占48.78%。这表明在超市零售鸡肉中耐药肠球菌的存在已较为普遍。

TGC对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌有广谱抗菌活性，包括多重耐药的革兰阳性菌，如 MRSA、VRE等[14]，为对抗“超级细菌”提供了重要保障。耐TGC肠球菌目前仅在人医临床有报道[15-16]，是造成人类严重感染的主要细菌之一。本研究中，自河南郑州的样品中检测到1株TGC耐药菌株，应当引起重视。此外，尽管肠球菌对氨基糖苷类药物低水平固有耐药，但氨基糖苷类药物与青霉素、糖肽类合用对肠球菌有协同治疗作用，在临床治疗上有应用价值[17]。2019年CHINET监测数据表明，粪肠球菌对高浓度庆大霉素(HLAR)的耐药率为39.8%[18]，而本研究鸡肉源粪肠球菌的HLAR为41.46%，刘洋等[19]报道北京和山东禽源肠球菌中,粪肠球菌的HLAR为26.6%；韩国一项研究表明鸡源分离株中粪肠球菌的HLAR为25.5%[20]；加拿大肉鸡和火鸡样品粪肠球菌的HLAR为9.6%[21]。因此，我国鸡肉源分离肠球菌对高浓度的氨基糖苷类耐药情况高于医院临床株，也比其他国家食品源肠球菌耐药率高。动物养殖过程中不合理使用抗菌药物，导致动物源和环境细菌耐药性日趋严重。肠球菌“作为抗生素耐药基因储库”可以将耐药基因转移至其他肠球菌和其他革兰阳性细菌。而食源性耐药肠球菌可能在消费者的肠道中定殖并将耐药基因转移到肠道微生物群中。因此加强鸡场肠球菌耐药性监测对控制耐药性传播、保障公共卫生和人类健康具有重要意义。

人医临床及动物源肠球菌中tetL、tetM、ermB检出率很高[22]，这些基因在本研究的鸡肉源肠球菌中也有较高的检出率。目前LZD是临床多重耐药革兰阳性菌，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MASA)及VRE感染的有效治疗药物[23]，LRE是目前最受人们关注的耐药肠球菌之一。LZD的获得性耐药机制主要由cfr和optrtA、poxtA这几种基因介导。自2015 年我国学者首次在肠球菌中发现可移动的新型噁唑烷酮类耐药基因optrA后，该基因已经在多种革兰阳性菌，如肠球菌、葡萄球菌和链球菌中被发现[24-25]。CAI等[26]也对2010—2014年医院随机收集的肠球菌中optrA基因进行了检测，检测结果表明optrA的阳性率呈现出一定的增长趋势的。2015年，WANG等[27]报道了optrA在食品动物源中的检出率约为20.3%，在人医临床株中分离率为4.2%。本研究中，41.46%(17/41)的菌株分离到optrA基因，高于先前报道中的检出率。畜禽专用药物FFC被证明与在动物中发现的LRE有着密切的关系[28-29]，出现这种现象可能与饲养过程中FFC的使用情况有关。与之前的研究报道相似[25,27]，肠球菌菌株携带optrA基因，但对LZD仍然敏感。

研究表明，肠球菌致病是由多种毒力基因和多重耐药性协同作用的结果[30]。近年来，肠球菌毒力基因越来越多被发现，毒力基因虽不是粪肠球菌致病力的唯一原因，但确实与致病力相关，两者之间的具体关系尚未明确[31]。因此，粪肠球菌携带的毒力基因对鸡的养殖、鸡肉及其食品安全有着重要的意义。毒力基因esp在肠球菌尿道感染中能使肠球菌定植在宿主细胞上，并且延长肠球菌细菌在膀胱内停留的时间。有研究认为esp基因更能在临床分离屎肠球菌中检测到，在非临床株以及动物分离株中并未检测到esp基因[32]，但本研究在2株鸡肉源粪肠球菌中检出了esp，应当引起一定重视。本研究禽源肠球菌携带的毒力基因主要是efaA、gelE、agg，与猪源肠球菌毒力基因检测结果[6-7]相似，

比较鸡肉源粪肠球菌所携带的毒力基因数与耐药型之间的关系发现，耐药率之间的差异在CIP、DOX、RFP、ERY、FFC、HLGR、HLSR中均不存在统计学意义。这与黄奕雯等[7]及祝进等[31]的研究发现粪肠球菌对多种药物的耐药率与毒力基因数无关联是一致的。粪肠球菌的耐药性与其毒力基因的个数的关系需进一步研究确定。

超市零售鸡肉样品中粪肠球菌耐药情况较为严重，携带的耐药基因和毒力基因流行且多样，这些肠球菌可能在人、动物甚至是环境之间进行相互传播，对公共卫生带来潜在危险。因此应加强对食品鸡肉源粪肠球菌耐药性监测。