巨噬细胞胞外囊泡在疾病治疗中的应用

范文霖， 聂伟东， 谢海燕

(1.北京理工大学生命学院，北京 100081；2.北京理工大学材料学院，北京 100081)

1 前言

巨噬细胞是血液中未完全分化的单核细胞被招募到外周系统中，并在接触了局部生长因子、促炎细胞因子和微生物产物等之后迅速分化而产生的[1,2]，具有特殊的免疫功能[3]，主要包括：(1)吞噬病原体、受感染的细胞、细胞碎片和死亡细胞等；(2)提呈抗原；(3)产生各种细胞因子和趋化因子，如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、CXCL9、CCL17等。巨噬细胞在不同的环境刺激下会极化为不同的表型，主要包括M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1具有促炎作用，可杀伤微生物和肿瘤细胞，M2具有抗炎作用，能促进组织修复和肿瘤发展。巨噬细胞在癌症、糖尿病、动脉粥样硬化等重大疾病中都起着重要作用，也可以为相关的治疗提供新思路。如，M1可以抵抗微生物感染和进行肿瘤治疗，M2则可以进行抗炎治疗和组织修复。

然而，目前基于巨噬细胞的疾病治疗仍面临诸多困难：例如无法长期监测或维持巨噬细胞的生物活性，这在一定程度上影响了巨噬细胞的治疗效果；巨噬细胞治疗更倾向于使用原代巨噬细胞，制备较繁琐、重复性较差；巨噬细胞治疗的安全性也需要考虑，如增强的细胞毒性可能引起细胞因子风暴和过激的炎症环境；且肿瘤微环境能够使巨噬细胞极化为M2组织修复表型，进一步增加肿瘤的恶性程度等[4]。

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是细胞分泌到胞外的膜性囊泡。在分泌过程中，核酸、蛋白等被包覆在囊泡内，不仅继承了亲本细胞的性质和功能[5]，还可以回避细胞治疗所面临的问题。因此，研究者们开始尝试利用细胞外囊泡代替细胞进行疾病治疗。细胞外囊泡根据粒径大小、结构特征和生物起源等因素可以分为外泌体(Exosomes)，微囊泡(Microvesicles，MVs)和凋亡小体(Apoptotic Bodies)三个亚型，其中粒径大概在30～100 nm的外泌体研究得最为广泛[6]。外泌体起源于细胞膜内陷形成的内体，在内体膜向内出芽形成腔内小泡(Intraluminal Vesicles，ILVs)的过程中，细胞质中的蛋白、脂质和核酸被分选进入小泡中，之后众多的ILVs聚集成为多泡体(Multivesicular Bodies，MVBs)。部分MVBs将被溶酶体降解，其余的MVBs与细胞膜融合将ILVs释放到细胞外空间，成为外泌体[7]。微囊泡是细胞在环境压力下通过细胞质膜出芽的方式释放到胞外的囊泡总称，粒径在100～1 000 nm之间[8,9]。凋亡小体是凋亡中的细胞通过细胞质膜出泡的形式释放到胞外的囊泡，尺寸约为1 000～5 000 nm[10]，除了含有来自母细胞胞浆的蛋白质等分子外，还含有细胞器、DNA片段和组蛋白[11]。鉴于上述的细胞外囊泡的特征，使得巨噬细胞胞外囊泡具有了重要的生物学功能。如，借助表面的蛋白趋化至肿瘤部位或炎症部位，利用携带的microRNA影响受体细胞的信号通路进而改善受体细胞的生理特性，表现出免疫抑制或免疫刺激作用；此外，细胞外囊泡还有穿越组织屏障的能力，如血脑屏障BBB等[12]。其较小的尺寸以及免疫原性低、无毒、稳定性高等优点也使得细胞外囊泡成为很好的诊疗生物材料[13]。在此基础上对其进行工程化改造可赋予细胞外囊泡新的特性和功能，通过与其天然性能结合，能达到更好的诊疗效果。

巨噬细胞胞外囊泡在疾病治疗中的主要作用如图1所示。

图1 巨噬细胞胞外囊泡在疾病治疗中的作用示意图Fig.1 Schematic diagram of the role of macrophage extracellular vesicles in disease treatment

2 天然巨噬细胞外囊泡用于疾病治疗

巨噬细胞是一种广泛分布于哺乳动物机体内的重要免疫细胞[14]，具有显著的可塑性，面对不同的环境刺激，它们能够改变自身的生理反应，表现出不同的表型[`4]。最典型的有两种：经典活化巨噬细胞(CAMs,M1型巨噬细胞)和替代性活化巨噬细胞(M2型巨噬细胞)，根据基因表达情况不同，M2型巨噬细胞又分为M2a、M2b、M2c和M2d四种亚型。M1表达高水平的促炎因子，产生活性氮和活性氧，促进辅助性T细胞Th1分化，并且有强的微生物和肿瘤杀伤活性。而M2促进组织重塑和肿瘤发展，并具有免疫调节功能[16]。M1和M2的细胞外囊泡也具有和其母细胞相似的功能，例如，Yang等[17]的研究表明，M2b的外泌体主要通过携带CCL1蛋白(M2b的特征之一是分泌CCL1趋化因子)到结肠与在Th2细胞和调节性T细胞(Treg)上表达的CCR8受体相互作用，显著减轻葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎。M2b外泌体进行治疗后，结肠炎小鼠脾脏中的Treg细胞数量增加、IL-4水平升高(Th2极化)，而与结肠炎相关的关键细胞因子(IL-1、IL-6和IL-17A)的表达水平显著降低，Th2型免疫应答与被DSS给药诱导的Th1型免疫应答相平衡，而Treg细胞平衡了DSS诱导的结肠炎炎性紊乱，从而达到缓解结肠炎的目的。

巨噬细胞具有肿瘤靶向性[18,19]，具有快速定向迁移到病理部位的能力，分泌特定的趋化因子，而实体肿瘤对趋化因子有高的渗透性，因此允许巨噬细胞定向聚集并浸润到肿瘤环境中；且肿瘤部位高分泌许多趋化因子，如CCL2和CCL5，能够确保巨噬细胞被招募到肿瘤部位[20]。巨噬细胞分泌的细胞外囊泡也被证明具有肿瘤靶向性，因此能够作为肿瘤特异性的药物递送系统。Rayamajhi等[21]将小鼠巨噬细胞的小细胞外囊泡(sEVs)与合成脂质体杂交得到杂交外泌体HE，同时装载水溶性Dox。sEVs提高了药物靶向性，增强了小分子的稳定性和延长了血液循环时间。具有促炎表型的M1过表达表面趋化因子受体CCR2，而肿瘤组织会产生单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1,CCL2)，它是C-C趋化因子家族的成员，能通过CCL2-CCR2机制将单核/巨噬细胞招募到肿瘤微环境中[22]。M1释放的细胞外囊泡也继承了供体细胞的特异靶向性。Guo等[23]用M1的细胞外囊泡分别和正常细胞CHO(中国仓鼠卵巢细胞)和肿瘤细胞SKOV3细胞(人卵巢癌细胞)共孵育，在肿瘤细胞中检测到了更高的细胞摄取率；此外，M1的细胞外囊泡(M1-EVs)用荧光团DiD标记后，腹腔给药于原位卵巢癌小鼠模型，观察到M1-EVs主要聚集在转移性结节中，肝脏较少，其他脏器中的荧光信号可以忽略，表明了其良好的肿瘤靶向性，而使用CCR2抑制剂后，转移性结节中的荧光信号显著减弱，说明CCR2可能与M1-EVs的肿瘤趋向性有关。

M2及其胞外囊泡具有抗炎特性，能够促进机体形成抗炎的微环境[24]。例如，M2的外泌体通过表面的趋化因子受体能够实现炎症趋化作用，然后在炎症部位释放抗炎细胞因子(如IL-10，IL-1Ra和TGF-β)，因而能表现出理想的抗炎作用[25]。在Wu等人的工作中[25]，通过电穿孔将己基-5-氨基乙酰磺酸盐(HAL)载入到M2的外泌体中，M2外泌体可以趋向炎症部位和发挥抗炎作用，而包封的HAL可进行血红素的胞内生物合成和代谢，产生抗炎的一氧化碳和胆红素，进一步增强抗炎作用，最终缓解动脉粥样硬化；同时，血红素生物合成途径的中间产物原卟啉IX(PpIX)能进行动脉粥样硬化的荧光成像和跟踪，为动脉粥样硬化的诊疗提供了新方法。Li团队[26]用低浓度为50 μg/mL，高浓度为500 μg/mL的巨噬细胞外泌体和高葡萄糖处理过的人脐静脉内皮细胞(GH-HUVEC)共孵育，发现TNF-α、IL-6等炎症因子的表达显著降低，表明巨噬细胞的外泌体具有抗炎作用。他们还发现巨噬细胞外泌体可提高Ⅰ型糖尿病小鼠的创面缩小率，并且这一过程与炎症的调节有关，说明巨噬细胞来源的外泌体可能是通过抗炎治疗糖尿病创面损伤的一种新策略。

M2还具有促进组织重塑的功能，其细胞外囊泡也对受伤的组织和细胞起到一些有益的作用。Dai等人的研究[27]显示，M2的外泌体携带有微小RNA-148a(miR-148a)，能通过下调硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)和钝化TLR4/NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路减轻心肌缺血再灌注(MI/R)损伤。当流向组织或器官的血流量减少时，就会发生缺血，妨碍氧气的供应，导致部分或全部组织/器官损伤。Gangadaran等[28]发现，巨噬细胞的细胞外囊泡(MAC-EVs)可以促进内皮细胞增殖、迁移和血管形成；在体内实验中，与对照组相比，MAC-EVs可促进小鼠基质胶栓内新的大血管形成。说明MAC-EVs可以促进血管生成从而治疗缺血性损伤疾病。小胶质细胞是大脑中常驻的免疫细胞，是一类特殊的巨噬细胞群体，中风导致的脑部损伤可以使小胶质细胞分化为M1和M2型巨噬细胞，其中M2型被认为具有治疗效果，显示对大脑的神经保护作用，并能改善中风后的长期神经效果[29 - 31]。Song等人的研究[32]显示M2小胶质细胞来源的外泌体能够减弱缺氧-葡萄糖剥夺后神经元的凋亡。M2小胶质细胞的外泌体还可显著减小脑缺血3天后的梗死体积并减轻行为缺陷，从而对缺血性中风起到治疗效果，这与外泌体携带的微小RNA miR-124进入神经元后下调泛素特异蛋白酶14(USP14)的表达有关。

巨噬细胞是一种能抵抗病原体感染的原生免疫细胞，巨噬细胞来源的细胞外囊泡对感染性疾病也起到一定的治疗作用。在Reales-Calderon等人的研究[33]中，被白色念珠菌感染的巨噬细胞的EVs能激活其他巨噬细胞的细胞外调节蛋白激酶ERK和p38激酶，增加其促炎细胞因子的分泌和抑制白色念珠菌的活性。Cheng和Schorey的研究[34]发现用结核分枝杆菌培养滤液蛋白(CFP)处理过的巨噬细胞外泌体可诱导CD4+和CD8+T细胞表达抗原特异性IFN-γ和IL-2。使用低剂量结核分枝杆菌小鼠气溶胶感染模型，发现来自CFP处理的巨噬细胞外泌体既可启动保护性免疫反应，又可促进卡介苗前期免疫，提示了巨噬细胞外泌体可能成为一种新型的抗结核分枝杆菌感染的无细胞疫苗。Velandia-Romero等人的研究[35]显示被登革热病毒DENV-2感染的U937巨噬细胞胞外囊泡可以转运由DENV RNA编码的非结构性蛋白质(NS3)，促进内皮细胞的细胞因子释放从而诱导内皮细胞的激活，并在疾病早期引发一种防御程序，抵御登革热病毒的侵害。这些研究提示巨噬细胞的胞外囊泡可能通过传递病毒物质或治疗分子来增强抗感染的免疫应答。

M1或M2的细胞外囊泡还具有相互极化的能力。Kim课题组[36]在体外和体内验证了M2的外泌体由于携带有调节因子CCL22,CCL24和MFG-E8可以将M1极化为M2，从而加速伤口的愈合。M1的纳米囊泡或其细胞外囊泡可以使M2向M1再极化，进而增强抗肿瘤效果[37]。Liu等人的研究[38]也显示M1的细胞外囊泡能够极化肿瘤处的M2(TAMs)为M1，从而达到对肿瘤细胞的吞噬和杀伤效果。

3 工程化巨噬细胞外囊泡用于疾病的治疗

天然巨噬细胞外囊泡应用于疾病治疗研究进展迅速，但仍有很多局限性。如：天然效力不足，特异性和靶向性不够强，不能及时从溶酶体逃逸等等。于是，研究者们开始思考如何对细胞外囊泡进行改造以增强其功能，得到了很多工程化改造的巨噬细胞胞外囊泡[39]。工程化改造细胞外囊泡主要可以分直接工程化(直接对细胞外囊泡本身进行改造)和间接工程化(对细胞外囊泡来源的细胞进行改造)两类。间接工程化修饰主要是利用基因工程、代谢标记和外源性传递的方法将靶向配体等表达在细胞膜上或装载进细胞中，进而表现在细胞形成的胞外囊泡上[40 - 43]。但是基于细胞的EVs功能化策略通常只能将总装载组分的一小部分包装进EVs中，装载效率低、成本高。而直接对纯化出的EVs进行功能化可确保所有修饰位点或被封装的物质都定位于细胞外囊泡中。直接工程化的方式也可以分为被动封装和主动封装两种，被动装载方法依赖于自发的相互作用，如共孵育[44]和多价静电相互作用介导的阳离子化合物结合到带负电的EVs膜表面[45]，而主动装载策略则需要暂时破坏EVs膜以允许装载物进入，包括电转[46]、脂质体介导[47]、冷热交替[48]、超声[49]、挤压[49]、膜渗透[50]等。这两种方法能将所需要修饰的抗体、靶向肽或者其他分子(化疗药[51]，siRNA[52])整合在囊泡里。

3.1 间接工程化

几十年来，研究人员已经尝试将非天然组分引入细胞以增强其治疗功能[53,54]。而这些组分中的许多会表现在细胞外囊泡中。例如，修饰在细胞膜的组分会自然地掺入微泡中，而内在化的组分可能会分泌到外泌体中。基因修饰、代谢标记和外源性传递等细胞工程技术已被证明可以改变细胞产生的细胞外囊泡表面蛋白表达和内容物[55]，从而提高细胞外囊泡靶向病灶的能力以及治疗疾病的效率。同时，经过工程化细胞得到的细胞外囊泡还可以再经过直接工程化改造使得其功能进一步加强。

比较简单的间接工程化方法包括通过物理包覆使细胞装载治疗组分，而后治疗组分能够被包装入其细胞外囊泡中，同时结合细胞外囊泡本身的靶向性等特性用于疾病的高效治疗。在Tang等人的研究[56]中，用地塞米松(dexamethasone，DEX)孵育RAW巨噬细胞后提取其微泡(MV)，得到装载有DEX的微泡MV-DEX，蛋白质组学分析显示，MV-DEX表面明显表达有整合素αLβ2(LFA-1)和α4β1(VAL-4)，使它们能够靶向有炎症的肾脏。在体外实验中，只有游离的DEX 1/5剂量的MV-DEX能通过抑制NF-κB的活性起到显著的抗炎作用。在体内实验中，与游离DEX等摩尔剂量的MV-DEX能显著减轻脂多糖(LPS)或阿霉素(ADR)诱导的肾病小鼠的肾损伤，并能增强对肾脏炎症和纤维化的治疗效果。巨噬细胞能够通过吞噬作用主动吞噬和内化大量的外源物质，因此与其他细胞相比可以在同样的纳米颗粒浓度和孵育时间下达到一种可观的细胞载荷。Silva等[57]将小分子光敏剂及Fe3O4纳米颗粒与巨噬细胞一起孵育，巨噬细胞分泌具有磁性和光响应性的细胞外囊泡，能够在体内进行磁靶向、磁共振成像和光动力治疗。

为了提高细胞外囊泡对病灶部位的靶向性，还可以在细胞培养基中添加能插入细胞膜的靶向肽从而使细胞和细胞外囊泡上带有靶向分子。Wang等[58]将巨噬细胞培养在含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)功能化DSPE-PEG(DSPE-PEG -RGD)和巯基功能化DSPE-PEG(DSPE-PEG-SH)的培养基中，用RGD和巯基修饰供体细胞的膜，然后提取其外泌体，外泌体也可以被RGD和巯基修饰(RGD -Exos-SH)。此外，还将外泌体表面通过共价键与另一种肿瘤特异性靶向配体叶酸(FA)连接，通过两种靶向配体的协同作用提高对肿瘤的靶向效果。

作为所有细胞操作策略中最完善的一种，基因工程也被用于间接工程化修饰EVs以治疗疾病。与简单的物理包覆不同，基因工程改造有更强的可操作性和更多的改造范围。利用转基因的手段将目的蛋白基因转染进母细胞中，能够得到表达有目的蛋白的EVs。例如，针对细胞外囊泡及其内容物溶酶体逃逸差的特点，通过基因工程的方法改造巨噬细胞可以使其上表达膜融合相关蛋白，从而使其细胞外囊泡直接与靶细胞膜融合而非进入溶酶体。在Liu等人的研究[38]中，能表达口腔炎病毒糖蛋白VSV-G的质粒被转染进M1型巨噬细胞中，提取其细胞外囊泡，则该囊泡上也表达有VSV-G蛋白，之后将PD-L1的小干扰RNA(siPD-L1)电转进此细胞外囊泡中，构建了一种病毒模拟核酸工程化的细胞外囊泡(siRNA@V-M1 EV)。给CT26荷瘤小鼠注射后，由于M1 EV的天然肿瘤归巢特性，这种工程化的细胞外囊泡能够靶向肿瘤组织。VSV-G是一种pH敏感细胞融合蛋白，可使该细胞外囊泡与靶细胞膜融合，促进siPD-L1直接释放到细胞质中而非溶酶体中从而引发有效的PD -L1基因沉默，有效阻断PD -L1/PD -1相互作用，进而使得CD8+T细胞数量升高。PD -L1/PD -1通路阻断、T细胞识别重建等联合应用，可以获得较好的抗肿瘤效果。

代谢标记也是一种理想的细胞功能化策略，可以避免基因操作过于复杂的问题。该方法通过向细胞培养基中补充非天然代谢产物(例如氨基酸，脂质，寡核苷酸或聚糖等)来改变细胞生物合成，这些代谢物被细胞吸收后能整合到蛋白质组、基因组、脂质和糖中[55]。采用代谢标记的方法能够对巨噬细胞进行工程化改造，从而得到具有功能基团的细胞外囊泡。Nie等[59]利用生物合成和磷脂代谢的方法将叠氮基团引入M1型巨噬细胞的细胞膜上，从而得到叠氮化的外泌体。随后通过pH敏感的苯甲酸-亚胺键将叠氮化的M1细胞外泌体(M1 Exo)和DBCO化的CD47/SIRPα两种免疫调节抗体(Ab)结合获得M1 Exo-Ab。经系统给药后，通过CD47抗体对肿瘤细胞表面CD47分子的特异性识别增强肿瘤细胞靶向。同时，在酸性的肿瘤微环境下，苯甲酰亚胺键被裂解，释放的抗体导致"don’t eat me"信号通路被阻断，从而能使巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬增强。

3.2 直接工程化

直接工程化修饰细胞外囊泡包括通过主动装载将药物包装进细胞外囊泡中，再利用细胞外囊泡本身的靶向性或者促炎等特性与药物联合起来治疗疾病。比如，Wang等[60]提取了M1的外泌体M1-Exos，通过超声将紫杉醇(PTX)装载到外泌体中，M1-Exos将PTX靶向递送到肿瘤组织中，同时M1-Exos能激活初始巨噬细胞的NF-κB通路，促进细胞因子释放，建立局部炎症环境，并通过caspase -3介导的途径增强抗肿瘤活性，两者的结合，使PTX-M1-Exos组的抗肿瘤效果显著增强。Haney等[61]通过超声或渗透化处理将TPP1装载进巨噬细胞外囊泡中，显著提高了TPP1抵抗蛋白酶降解的能力以及递送到靶细胞的效率；腹腔注射EV-TPP1后，在晚期婴儿神经元型蜡样脂褐素病(LINCL)小鼠模型中表现出了EVs的脑积聚和小鼠寿命的延长。

通过物理包裹将疏水性药物包裹到EVs中是被动装载的一个例子。疏水相互作用能有效地驱使小的亲脂性物质自发整合到EVs膜中，并且在温和的环境条件(25～37 ℃)下进行简单的共孵育就能实现，其负载效率与外源物质的疏水性成正相关[62]。在Ding等人的研究[63]中，将M1外泌体(M1 Exo)与双[2,4,5-三氯-6-(戊氧基羰基)苯基]草酸酯(CPPO)和光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)在37 ℃共孵育，通过疏水相互作用将二者装载在外泌体膜上，随后将前药阿霉素(Dox-EMCH)电转进外泌体中，构建了一种可以自我激活的载药外泌体(M1CCD)，以实现肿瘤的化学能激发的PDT、免疫治疗和化疗三模式治疗。

在细胞外囊泡表面连接靶向肽等是提高其特异靶向性的重要手段，由于不需要考虑细胞活性，其反应条件较间接工程化更为广泛，也因此有了更为多样的修饰方法。Kim等[64]通过超声将紫杉醇(PTX)装载到巨噬细胞的外泌体中，并在其表面通过被动装载连接氨基乙烷基对甲氧苯甲酰胺-聚乙二醇(AA-PEG)使其能够靶向肺癌细胞上过表达的sigma受体从而显著提高了化疗效果。除共孵育的方法外，通过化学反应在囊泡的膜上连接靶向肽是更为准确且高效的修饰方法。Li等[65]开发了一种巨噬细胞来源的外泌体包覆聚乳酸-乙醇酸(PLGA)纳米平台用于三阴性乳腺癌的靶向化疗。他们将外泌体膜包覆在装载有阿霉素的PLGA纳米颗粒上，外泌体的表面通过共价连接用一种多肽修饰以靶向三阴性乳腺癌细胞上过表达的间充质-上皮过渡因子(c-Met)。他们还在体外和体内的实验中发现所设计的外泌体包覆纳米平台具有良好的肿瘤聚集效果，能显著提高化疗药物的肿瘤抑制效率。

4 总结与展望

细胞外囊泡(EVs)相关的研究方兴未艾。与无机有机等化学纳米药物相比，EVs具有生物内源的固有特点，同时其具有结构稳定性高、功能化操作简便等优点。而且，细胞外囊泡还具有与巨噬细胞相似的性质和功能，如趋炎和抗炎特性、肿瘤靶向性、极化巨噬细胞为M1/M2型、组织修复能力、抗病原体感染等，在癌症诊断、液体活检、基因治疗与免疫疗法等领域均有重要应用价值。

巨噬细胞外囊泡本身的内容物如蛋白和核酸等可以直接影响受体细胞的生理性质因而可以直接作为治疗疾病的介质，而工程化改造后的巨噬细胞外囊泡更是提高了其靶向能力和治疗效果，相关研究也越来越多，从简单的物理包覆到基因工程改造再到代谢标记，通过改造细胞来功能化囊泡的技术逐渐趋向于在优化功能的同时简化操作，而直接工程化改造囊泡则由于不需要考虑活细胞而使得操作更为简便，可能在未来的囊泡工程化中成为主要的改造方法，这些技术的进步将推动该领域的快速发展。但工程化改造仍有许多问题需要考虑。例如，外来组分是否可以在结合EVs的同时不破坏其功能?引入外来物质是否会产生有害的免疫原性？改造也可能会改变膜的刚性从而改变EVs的细胞结合能力等。此外，目前EVs的研究工作还主要集中在动物实验及预临床实验中，需要更多的实验来支持实际的临床应用。同时，巨噬细胞的EVs的机理研究工作仍需进一步开展，例如其生物发生途径、结构与组成以及生物学功能之间的关联，这对于疾病的诊断与治疗过程至关重要。虽然目前基于巨噬细胞EVs的研究充满了未知与挑战，但巨噬细胞EVs在疾病治疗领域的应用前景仍然是广阔无垠的。