艾炷灸对CTX骨髓抑制大鼠模型外周血及肝功能的影响

谭 丽，谢 煜，陈洪达，王 宁*

(1.深圳市龙华区中心医院，广东 深圳 518110；2.广东省中医院，广东 广州 510120；3.中山大学附属第七医院，广东 深圳 518107)

艾灸是传统中医药外治法的一种，在防病治病方面已有数千年历史，现代实验研究证实艾灸可以提高机体免疫功能。临床研究发现，艾灸足三里可以治疗化疗后骨髓抑制状态[1-2]。骨髓抑制是肿瘤化疗后常见的不良反应，据统计80%患者在肿瘤化疗过程中均会出现骨髓抑制，对免疫系统及造血功能影响最为明显，其中白细胞减少最为突出，严重影响免疫系统功能，临床常出现严重的感染、出血等症状[3]。改善化疗后的骨髓抑制在治疗肿瘤中具有积极作用。因此，本研究采用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)溶液建立稳定的骨髓抑制模型[4-7]，选择不同灸量的艾炷灸干预骨髓抑制大鼠模型，观察其对大鼠模型外周血细胞及肝功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级SD 雄性大鼠30只(购于南方医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK(粤)2016-0041)，体质量为(200±20) g。将30只SD大鼠饲养于中国中医院科学院广东分院SPF级动物房，室温20～25 ℃，相对湿度50%～70%，饲养环境清洁、安静。喂养7天后，采用SPSS软件的随机数生成功能将大鼠随机分为5组，每组6只大鼠，即对照组、模型组、艾灸1组、艾灸2组、艾灸3组。对照组正常饲养，不予干预。

1.2 药物及仪器

药品：环磷酰胺：5 g/瓶(H20160467，公司：德国Baxter Oncology GmbH)；灭菌注射用水。溶液配制：称取500 mg CTX，溶于50 mL灭菌注射用水，震荡后完全溶解，配置成10 mg/mL的CTX溶液，现配现用。仪器：迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪，型号：BC-2800vet。艾绒：陈艾绒(35∶1)，250 g/包(北京国医研医药技术开发有限公司，企业标准：Q/DGYY 0001-2017)。

1.3 模型建立与干预

模型建立：模型组和艾灸组从造模开始，各组大鼠每天同一时间段行腹腔注射CTX溶液(剂量40 mg/kg)，1次/天，连续 5 天。根据前期研究，造模第5天骨髓抑制模型成立。当模型建成后，采用原剂量减半(20 mg/kg)且隔天注射的方法，维持到造模第13天，停止药物注射。

选穴与治疗：大鼠穴位的选取根据《实验针灸学》，足三里穴：位于大鼠后肢膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm 处。为了保证每个艾炷的体积相当，将艾炷做成直径3 mm、高3 mm的圆锥形艾炷。将大鼠穴区1.5 cm×1.5 cm范围内的鼠毛剃掉，暴露皮肤。造模第6天开始艾灸，将做好的艾炷放置于施灸的穴位上，穴位上涂医用凡士林，然后用线香点燃，待艾炷燃至大鼠挣扎时，用镊子迅速更换艾炷，从左侧足三里穴开始，再到右侧足三里穴。艾灸1组每穴 3壮/次，艾灸2组每穴 6壮/次，艾灸3组每穴 9壮/次，每日1次，连续灸7天。

1.4 指标采集及检测

各组在造模第5、13天对大鼠尾巴用75%酒精消毒，进行尾静脉取血，弃掉第一滴血，然后滴入2支加有5%EDTA抗凝EP管，各收集1.5 mL，混匀后采用全自动血液细胞分析仪对各组大鼠尾静脉外周血中白细胞(White blood cell，WBC)、淋巴细胞(lymphocyte，Lym)、单核细胞(Monocyte，Mon)/中性粒细胞(Granulocyte，Gra)、红细胞(Red blood cell，RBC)、血红蛋白(Hemoglobin，Hb)、血小板(Platelet，PLT) 数量进行检测。另一支EP管中的血静置2 h后，离心15 min，转速为3 500 r/min。离心后取250 μL血清装入冻存管，用ELISA法观察大鼠谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)含量变化，了解造模及艾灸对肝脏的影响。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 造模完成后各组大鼠外周血细胞变化

造模完成后各组大鼠外周血WBC、Lym、Mon、Gra含量均低于对照组(P<0.05)，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；各组大鼠外周血PLT均降低，其中艾灸1组、艾灸2组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，模型组与艾灸3组差异无统计学意义(P>0.05)；外周血Hb均降低，其中艾灸1组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、表2。

表1 造模完成后各组大鼠外周血细胞含量比较

表2 造模完成后各组大鼠外周血PLT的Kruskal-Wallis 检验

2.2 艾灸治疗后骨髓抑制大鼠模型外周血细胞含量变化

艾灸治疗后，艾灸各组大鼠外周血WBC及Lym成上升趋势，其中艾灸2组、艾灸3组的外周血WBC、Lym较模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，艾灸1组的外周血WBC、Lym与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；艾灸各组外周血Mon、Gra、PLT呈上升趋势，但与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后外周血RBC、Hb未见明显上升。详见表3。

表3 艾灸后各组大鼠外周血细胞含量的组间比较

2.3 骨髓抑制模型大鼠艾灸前后外周血细胞含量变化

艾灸治疗后，艾灸1组大鼠外周血Mon的含量较治疗前明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，其中外周血RBC、PLT较前有上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；艾灸2组的大鼠外周血WBC、Lym、Mon含量较治疗前明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，其中外周血Gra、RBC、PLT较治疗前上升，差异无统计学意义(P>0.05)；艾灸3组大鼠外周血WBC、Lym、PLT的含量较治疗前明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，其中外周Mon、Gra较前有上升趋势，差异无统计学意义(P>0.05)；模型组在造模第13天，大鼠外周血Hb较前下降，差异有统计学意义(P<0.05)。其余指标无差异。详见表4。

表4 骨髓抑制模型大鼠艾灸前后外周血含量的独立样本检验

2.4 艾灸对骨髓抑制模型大鼠肝功能的影响

艾灸治疗后，模型组与对照组相比，大鼠血清ALT、AST均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；艾灸1组大鼠血清ALT、AST较模型组比均下降，其中AST含量与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；艾灸2组与艾灸3组大鼠的AST含量较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而ALT含量较模型组下降，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5和图1。

表5 各组大鼠艾灸后血清ALT、AST含量变化

图1 艾灸后各组大鼠外周血细胞组间比较

3 讨论

CTX作为临床中常用的烷化剂化疗药，在建立骨髓抑制模型方面主要因其效果稳定、较易获得、成本不高而广泛推广，而其造成的骨髓抑制的机制主要是通过破坏骨髓造血干细胞DNA，造成造血细胞的不规则坏死、凋亡，引起造血前体细胞的活性下降，出现骨髓抑制[8-10]。但停止造模后，模型组外周血可逐渐恢复正常。因此采用常规造模剂量结合维持剂量联合造模才能保持模型的稳定性。本实验结果提示，常规40 mg/kg剂量结合20 mg/kg隔天维持剂量可以很好地维持模型的稳定性，在造模第13天仍能维持与造模第5天同一水平的指标，但Hb较刚开始造模有所下降，考虑与红细胞凋亡时间较长有关。

艾灸作为一种中医特色疗法，具有温阳散寒、活血化瘀、调和气血、协调阴阳、扶正祛邪的作用，现广泛应用于临床，主要包括直接灸(艾炷灸)和间接灸。而临床中发现艾炷灸在治疗化疗后白细胞减少及改善患者生活质量方面的效果要优于其他灸法[11]。根据1985-2018年艾灸治疗骨髓抑制的经穴频次分析，发现临床使用频次最高的穴位为足三里[12-13]。足三里穴为胃经的合穴，属“土穴”，能够补益本经的气血，自古被认为是补益的要穴，如《灵枢》：“阴阳俱有余，若俱不足，则有寒有热。皆调于足三里”，《通玄指要赋》：“三里却五劳之羸瘦”。可见足三里是治“虚劳”的要穴，不仅可以补益后天之本，促使气血生化，更可益气补虚，改善肿瘤患者的“本虚”状态。因此本研究采用艾炷灸作为干预方法，足三里穴为施灸穴位。

实验结果表明，艾炷灸可以升高骨髓抑制模型大鼠外周血白细胞含量，主要以升高淋巴细胞为主，而且随着艾炷的壮数增加，升高白细胞数量的差异越来越明显。白细胞为机体中重要的免疫细胞，艾灸可明显升高淋巴细胞，主要以T淋巴细胞为主，可调节外周血中CD3+、CD4+、CD8+T细胞的含量，提高充分免疫应答效应[14-15]。相关研究表明[16-18]，艾灸可以通过促进骨髓细胞周期蛋白以及修复基因的表达，增强细胞 DNA 的合成，提高化疗后骨髓基质细胞支持造血的能力及血清集落刺激因子的活性，促使造血干/祖细胞增殖。而艾炷灸对皮肤的烧灼可以激发炎症组织对热休克蛋白(HSPs)的大量表达，进而抑制IL-1、TNF-α等炎症因子的表达[19-20]。因此，笔者认为艾炷灸可能通过炎症介导的相关机制激发免疫应答、促进骨髓造血细胞的增殖与迁移。

ALT、AST为评价肝细胞损伤的有效指标，ALT与药物中毒性肝细胞坏死相关。CTX在应用中发现可致肝损伤，表现为血清转氨酶、胆红素等指标升高，其损伤机制可能与氧化应激有关，主要降低正常小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)的活力，升高丙二醛 (MDA)含量[21]。在骨髓抑制模型的建立中可以发现，肝脏ALT、AST含量均明显升高，但经艾炷灸治疗后，ALT下降，而AST无明显变化，由于AST主要分布于心肌，其次是肝脏、骨骼肌等组织中，说明艾炷灸并没有加重肝细胞损伤，而且在一定程度上可减轻肝细胞损伤。

综上所述，艾炷灸可以减轻CTX骨髓抑制大鼠模型的骨髓抑制状态，以升高CTX骨髓抑制大鼠模型外周血WBC、Lym细胞的含量为主。在本实验中，艾炷灸的灸量与外周血细胞的升高存在一定的相关性，且在治疗过程中艾炷灸未加重模型大鼠肝细胞损伤。