二斑叶螨取食抗、感螨木薯品种对茉莉酸信号途径基因表达的影响

韩志玲 陈青 梁晓 伍春玲 刘迎 伍牧锋 徐雪莲

（1. 海南大学植物保护学院，海口 570228；2. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带作物病虫害生物防治工程技术研究中心，海口 571101；3. 中国热带农业科学院三亚研究院/海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室，三亚 572000）

木薯（Manihot esculenta Crantz）是全球热带地区仅次于水稻和玉米的第三大粮食作物［1］，为100多个国家近10亿人口提供碳水化合物来源［2-3］，同时木薯广泛应用于食品加工、饲料加工和新能源开发等领域，市场需求量大［4］。我国木薯主栽区有广西、海南、云南、广东、福建、江西等［5-6］，但当前70%以上的木薯原料依赖进口，远远不能满足生产加工需要［4］。

二斑叶螨（Tetranychus urticae Koch）是世界危险性害螨，寄主植物超过1 100多种［2，7］，该螨为木薯四大有害生物之一［8］，主要以成虫或若虫刺吸叶片为害，为害初期仅在叶脉附近出现失绿斑点，中后期斑点逐渐扩大连片，叶片大面积褪绿褐化。虫口密度大时，被害叶片布满丝网，提前脱落［7］，阻碍植株营养生长，引起产量大幅下降，严重时可导致绝收，对木薯的安全生产构成严重威胁［9-10］。当前二斑叶螨的防治依然依赖于化学药剂，但由于其生活史短、繁殖速度快、环境适应能力和隐蔽性强，加之农药的不合理使用导致二斑叶螨对多数杀螨剂产生了不同程度的抗性［11］，同时也造成产品和产地生态环境安全问题突出。因此，亟需发展绿色高效、环境友好的二斑叶螨防控新策略。

诱导和提高作物自身的免疫防御反应在害虫防控中的重要性越发得到重视［12-14］。茉莉酸（jasmonic acid，JA）是自然界中广泛存在的一种植物内源激素，在植物生长、发育及逆境胁迫过程中发挥重要作用［15］，同时还是激活植物免疫防御系统的信号分子［16-18］。无论是植物内源产生的JA，还是外源喷施的JA类物质均能在作物被有害生物胁迫时激活植株防御反应，诱导JA信号途径介导的作物抗性相关的基因表达量、蛋白酶活性、次生代谢物质含量等的变化［19-23］。研究表明，上述生理生化指标的变化幅度与作物受害程度和时间关系密切，这在烟粉虱与番茄［24-25］、小绿叶婵与茶树［26］、柑橘全爪螨与柑橘［27］、益生菌EG-2与辣椒［28］的互作研究中均得到证实。

迄今为止，对于二斑叶螨与木薯互作时，是否影响JA信号途径基因表达的害螨密度和取食时间效应仍鲜见报道。本研究以抗、感螨木薯品种为参试材料，系统分析比较不同密度二斑叶螨取食不同时间后，JA信号途径关键基因的表达量变化趋势及其在抗、感螨木薯品种间的差异，以初步明确引起抗、感螨木薯品种JA信号途径基因显著差异表达的害螨密度和取食时间范围，为阐明茉莉酸信号途径在木薯抗虫性中的重要作用及抗螨种质资源鉴定评价提供理论依据与参考指标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试二斑叶螨 二斑叶螨为农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室室内以豇豆长期继代饲养的试验种群。饲养条件为温度（28±2）℃，相对湿度为（75±5）%，光照为L 16 h/8 h D。选择发育历期相同、大小一致的雌成螨进行后续试验。

1.1.2 供试木薯 抗螨木薯种质C1115，感螨木薯种质面包［29］由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃提供。木薯以种茎进行营养繁殖，种植土（土壤∶泥炭土∶珍珠岩=1∶1∶1）湿度保持在（75±5）%，自然光种植。待木薯生长约60 d后，选择长势一致的健康抗、感螨木薯植株进行害螨接种［29］。

1.2 方法

1.2.1 害螨接种与取样 每株木薯选择植株中部对应相同位置的叶片，用吸虫器小心吸取不同数量的二斑叶螨接种于单张木薯叶片的背面，每张叶的害螨密度分别设置为15、25、35、45、50和55头螨/叶，并在叶柄基部涂抹羊毛脂以防止害螨逃逸。分别于螨害1、2、4和8 d后采集不同害螨密度的叶片，并将叶背的害螨移除后提取叶片RNA，同时以同一时间采集的未接螨的相同品种木薯叶片为对照，每个螨害密度和螨害时间均设置3个重复。

1.2.2 RNA提取及cDNA第一条链的合成 参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN，美国）说明书提取木薯叶片RNA，取去除gDNA后的RNA样品1.0 μg进行cDNA第一条链的合成，合成方法参照RT EasyMix for qPCR试剂盒（TOLOBIO，中国）。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析 根据GenBank中已经发布的木薯JA信号途径关键基因DAD1、LOX2、OPR3和JAR1序列设计qPCR引物（表1）。cDNA样品经RNase-free ddH2O稀释160倍后作为qPCR的模板，以木薯Metub为内参基因［30］（表1）。qPCR反应体系的配制参照2×Q3 SYBR qPCR Master Mix试剂盒（TOLOBIO，中国）。qPCR反应条件为95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。使用LightCycler®96仪器（Roche，瑞士）默认溶解曲线程序采集溶解曲线。分别以未受螨害的木薯JA途径基因的表达量归一化设置为1.0，螨害后的JA途径基因的表达量变化情况以为害前的相对倍数表示，根 据Livak等［31］的2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt2-ΔCt1，ΔCt1为2个样本内参基因的Ct值差值，ΔCt2为2个样本目的基因的Ct值差值）方法计算而得，每个处理均设置3个重复，目的基因在2个样本间的相对表达量为3个重复的平均值。

表1 木薯JA信号途径基因qPCR分析的引物Table 1 qPCR primers for the the expression analysis of jasmonic acid（JA）pathway genes in cassava

1.2.4 数据分析 采用Excel进行数据汇总整理，使用统计学软件DPS（V15.10）进行不同害螨密度和不同为害时间的基因表达量差异分析，采用Duncan’s新复极差法进行数据间的多重比较（显著性水平均为α=0.05）。

2 结果

2.1 抗、感参照木薯品种被不同密度二斑叶螨取食不同时间后OPR3表达量差异分析

图1结果表明，抗、感木薯品种被不同密度二斑叶螨取食不同时间后JA信号途径基因OPR3表达量变化趋势差异显著。随害螨密度的增加及为害时间的延长，抗螨木薯品种C1115中OPR3表达量总体上均呈现出先显著升高再显著降低的趋势（P＜0.05），其中在35-50头螨/叶的害螨密度下以及1-2 d的为害时间内，OPR3的表达量均维持在为害前的2.89倍以上。而感螨木薯品种面包的OPR3表达波动较大，在15-25头螨/叶时OPR3表达量随害螨密度增加而显著降低（P＜0.05），在35-50头螨/叶时表达量又随害螨密度增加而显著升高（P＜0.05），并且在45-50头螨/叶，为害1-4 d的时间内，OPR3的表达量均维持在为害前的2.15倍以上，而过高的害螨密度和较长的为害时间均导致抗、感木薯品种中OPR3表达量的显著降低。进一步比较抗、感品种之间OPR3的表达量差异发现，在害螨密度为25-50头螨/叶范围内，在为害时间为2-4 d时，C1115的OPR3表达量显著高于面包（P＜0.05）。总之，发现35-50头螨/叶，为害2 d后，抗、感木薯品种的OPR3表达量均较为害前显著提高，并且2个品种间的表达量差异最显著，即抗螨品种中OPR3表达量显著高于感螨品种（P＜0.05）。

2.2 抗、感参照木薯品种被不同密度二斑叶螨取食不同时间后LOX2表达量差异分析

通过对二斑叶螨取食后的抗、感木薯品种叶片中LOX2表达量分析，结果（图2）表明，抗、感木薯品种被不同密度二斑叶螨取食不同时间后JA信号途径基因LOX2表达量变化趋势差异显著。随害螨密度的增加及为害时间的延长，抗螨木薯品种C1115中LOX2的表达量总体上均呈现出先显著升高再显著降低的趋势（P＜0.05），其中，在50-55头 螨/叶的害螨密度下以及1-2 d的为害时间内，LOX2的表达量均维持在为害前的2倍以上，8 d时LOX2的表达量急剧降低至螨害前水平。而感螨木薯品种面包的LOX2表达量与抗螨木薯品种C1115的LOX2表达量呈相反趋势，LOX2表达量随害螨密度的增加及为害时间的延长呈现出先显著降低再显著升高的趋势，在45-50头螨/叶时LOX2表达量随害螨密度增加而显著降低（P＜0.05），并且在45-50头螨/叶，为害1-4 d的时间内，LOX2的表达量下降到螨害前水平。进一步比较抗、感品种之间LOX2的表达量差异发现，在害螨密度为45-50头/螨范围内，在为害时间为2 d时，C1115的LOX2表达量显著高于面包（P＜0.05）。综上所述，发现45-55头螨/叶，为害2 d后，抗、感木薯品种的LOX2表达量均较为害前显著提高，并且2个品种间的表达量差异最显著，即抗螨品种中LOX2表达量显著高于感螨品种（P＜0.05）。

2.3 抗、感参照木薯品种被不同密度二斑叶螨取食不同时间后DAD1表达量差异分析

通过对二斑叶螨取食后的抗、感木薯品种叶片中DAD1表达量分析，结果（图3）表明，抗、感木薯品种被不同密度二斑叶螨取食不同时间后JA信号途径基因DAD1表达量变化趋势差异显著。随害螨密度的增加及为害时间的延长，抗螨木薯品种C1115中DAD1的表达量总体上均呈现出先显著升高再显著降低的趋势（P＜0.05），其中，在15头螨/叶的害螨密度下以及2-4 d的为害时间内，DAD1的表达量均维持在为害前的4.37倍以上。而感螨木薯品种面包的DAD1的表达量又随害螨时间增加而呈现先显著升高后降低的趋势（P＜0.05），并且在35、45和55头螨/叶，为害2 d的时间内，DAD1的表达量均维持在为害前的2.56倍以上，而过高的害螨密度和较长的为害时间将导致抗、感木薯品种中DAD1表达量的显著家升高。进一步比较抗、感品种之间DAD1的表达量差异发现，在害螨密度为15头/螨范围内，在为害时间为2-4 d时，C1115的DAD1表达量显著高于面包（P＜0.05）。综上所述，发现15、35、45和55头螨/叶，为害2 d后，抗、感木薯品种的DAD1表达量均较为害前显著提高，并且2个品种间的表达量差异最显著（P＜0.05）。

图3 不同密度二斑叶螨为害不同时间后DAD1的相对表达量Fig. 3 Relative transcriptions of DAD1 gene in miteresistant and mite-susceptible cassava cultivars after infested by the mites of different densities at different time

2.4 抗、感参照木薯品种被不同密度二斑叶螨取食不同时间后JAR1表达量差异分析

通过对二斑叶螨取食后的抗、感木薯品种叶片中JAR1表达量分析，结果（图4）表明，抗、感木薯品种被不同密度二斑叶螨取食不同时间后JA信号途径基因JAR1表达量变化趋势差异显著。随害螨密度的增加及为害时间的延长，抗螨木薯品种C1115中JAR1的表达量总体上均呈现出先显著升高再显著降低的趋势（P＜0.05），其中在45-55头螨/叶的害螨密度下以及1-2 d的为害时间内，JAR1的表达量均维持在为害前的1.9倍以上。而感螨木薯品种面包的JAR1的表达量随害螨密度增加而显著降低（P＜0.05）。在15头螨/叶，为害1-2 d的时间内，JAR1的表达量均维持在为害前的0.85倍以上，而过高的害螨密度和较长的为害时间将导致抗、感木薯品种中JAR1表达量的显著降低。进一步比较抗、感品种之间JAR1的表达量差异发现，在害螨密度为45-50头/螨范围内，在为害时间为1-2 d时，C1115的JAR1表达量显著高于面包（P＜0.05）。综上所述，发现35-50头螨/叶，为害2 d后，抗、感木薯品种的JAR1表达量均较为害前显著提高，并且2个品种间的表达量差异最显著，即抗螨品种中JAR1表达量显著高于感螨品种（P＜0.05）。

图4 不同密度二斑叶螨为害不同时间后JAR1的相对表 达量Fig. 4 Relative transcriptions of JAR1 gene in miteresistant and mite-susceptible cassava cultivars after infested by the mites of different densities at different time

3 讨论

JA信号途径在作物免疫防御反应中发挥重要作用［32-34］，而该信号防御途径由多基因控制［35-39］。DAD1编码叶绿体磷脂酶AI，催化磷脂转化成亚麻酸，是JA生物合成的第一步［40］。12-氧-植物二烯酸还原酶（12-oxo-phytodienoic acid reductase，OPR）和脂肪氧化酶（lipoxidase，LOX）是JA生物合成途径中的2个关键酶。OPR控制JA合成的最后步骤，将OPDA还原生成JA的前体，而LOX控制JA合成的初始步骤，将不饱和脂肪酸氧化成氢过氧化物［41］。当植物受到有害生物为害时，体内激活脂氧合酶基因LOX，诱导JA及MeJA的合成和积累，而生成的JAs又可进一步激活LOX，促进JAs的积累［42］。在LOX表达受抑制后，JAs和防御相关物质的合成受阻，植物易受害。在JA信号途径中，JA可以在JAR1（jasmonate resistant 1）的催化下主要是与异亮氨酸（Ile）结合生成复合物JA-Ile，该复合物与茉莉酸受体COI1（COR-insensitive 1）特异性结合之后，在E3泛素连接酶SCFCOI1复合物的作用下促使JAZ（jasmonate-zimdomain protein 1）蛋白的泛素化并使之被26S蛋白酶体降解，释放出MYC2（myelocytomatosis proteins 2），从而启动JA早期应答基因的转录［43］。若JAR1基因发生突变可导致JA信号级联传递受阻［43］。Guo等［44］在水稻抗虫性研究中发现OPR3在中抗水稻品种中能够过量表达，增强对二化螟的抗性，而AOC的过度表达，增加了水稻对褐飞虱的抗性。范东哲等［19］发现抗、感蚜辣椒品种被桃蚜为害后，JA信号途径基因LOX2、AOC表达量在抗蚜辣椒品种中先显著上升，随后又逐渐降低至为害前水平，但在感蚜辣椒品种中这两个基因被显著抑制，其表达量显著低于抗蚜辣椒中的水平。本研究发现受二斑叶螨为害后，上述基因在抗、感螨木薯品种中的表达量表现出显著不同的变化趋势，表明茉莉酸信号途径介导的防御反应可能因木薯品种的抗性差异而有所差别。

有害生物的虫口密度和为害时间能显著影响作物茉莉酸信号途径基因的表达［45-47］。张海波［45］以感烟粉虱品种苏椒15号和抗烟粉虱品种新苏椒五号为材料，研究烟粉虱在不同虫口密度（0、30、60、90和120头/叶）下取食不同时间（0、2、12、24、48、72和96 h）对辣椒叶片JA信号途径相关基因（LOX、AOC和OPR3）表达量的影响，发现当烟粉虱虫口密度以60头/叶取食后对抗、感2个辣椒品种叶片中JA含量的影响显著高于其余密度水平，并呈现先下降后上升的趋势；在处理24-96 h内可诱导抗虫品种JA途径基因LOX、AOC上调表达，且表达量均高于感虫品种，OPR3呈下调表达，且表达量低于感虫品种。刘勇［47］分析了蓟马取食菜豆不同时间（0、1、6、12、24和48 h）对JA途径关键基因表达量的影响，发现在蓟马取食菜豆6 h时，LOX最先出现表达峰值，随后AOS表达量在12 h出现第一个高峰期，这两个防御基因的表达量在蓟马取食诱导后的48 h均达到第二个峰值。张镇川等［36］通过检测不同浓度（1、0.1、0.01和0.001 μmol/L）冠菌素注射番茄叶片之后防御基因表达量变化，发现用1 μmol/L冠菌素处理番茄可诱导LOXD、MYC2、PAL5等基因的高表达；0.001和0.01 μmol/L的冠菌素处理会导致番茄叶片MYC2和LOXD的下调表达。本研究发现在较高的害螨密度（45-50头螨/叶）和较短的为害时间（螨害2 d）处理下，抗螨木薯品种茉莉酸信号途径关键基因LOX2、OPR3和JAR1的表达量不仅显著高于其螨害前的水平，而且也显著高于感螨木薯品种在同个处理条件下的表达量，而在其他的害螨密度和为害时间处理时，上述基因在抗、感螨品种间的相对表达量并没有统一的变化趋势，推测二斑叶螨短时间为害时（例如螨害1 d），由于木薯植株受损程度较轻，能快速诱导茉莉酸信号途径基因的表达，因此，上述基因在抗螨木薯品种中被诱导的程度并不一定高于感螨木薯品种，而随着害螨密度的提高和螨害时间的延长，抗螨木薯C1115受螨害程度显著低于感螨木薯面包，使得上述基因在C1115中的表达量也显著高于面包，而较高的害螨密度和较长的螨害时间处理均超出了抗、感螨木薯的耐受螨害的阈值水平，因而在此密度下上述基因的相对表达量并无固定的变化规律。

本研究一方面初步阐明了基于茉莉酸信号途径的木薯抗螨性分子机理，另一方面表明上述基因可能具有作为鉴定评价木薯抗螨性水平的分子指标的潜力。但必须指出的是，本研究仅仅比较了单个抗螨和感螨木薯品种之间的基因表达差异，上述评价指标在抗、感螨木薯品种群体中是否具有通用性和适用性仍需后续研究进一步证实。

4 结论

较高的害螨密度和较短的为害时间处理时，木薯茉莉酸信号途径关键基因LOX2、OPR3和JAR1在抗螨木薯品种中的表达量显著高于感螨木薯品种。