宿根矮化病抗感甘蔗品种茎部内生真菌和细菌群落特征分析

高小宁 刘睿 吴自林 吴嘉云

（1. 广东省科学院南繁种业研究所，广州 510316；2. 广州甘蔗糖业研究所湛江甘蔗研究中心，湛江 524300）

甘蔗（Saccharum spp. hybrids）是我国最重要的糖料作物，宿根栽培因其节种、省工、早熟及节本增效成为一项重要的甘蔗栽培制度［1］。甘蔗宿根矮化病（ratoon stunting disease，RSD）是由木质部赖氏菌木质部亚种（Leifsonia xyli subsp. xyli）引起的一种世界范围广泛发生的细菌性病害。感染RSD的甘蔗植株出现矮化、分蘖减少、节间缩短，蔗糖分降低，在宿根蔗中极易发生［2］。对我国甘蔗主产区（广西、云南、广东和海南）的12个蔗区和15个甘蔗栽培品种的调查和检测发现，RSD在我国主蔗区发生普遍，是影响宿根蔗产量的重要因素之一［3］。尤其是在干旱条件下，RSD可导致60%的产量损失及蔗糖分降低0.5%［4］。为了有效控制宿根矮化病在生产中所带来的产量和经济损失，自该病害被报道以来，研究人员从组织形态变化、生理生化特性、基因表达特征、蛋白组学等不同方面研究了甘蔗与RSD致病菌的互作机制，从而为了解RSD发生规律和有效防控措施的提出奠定了理论基础［5-8］。

植物内生微生物生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内部，在与寄主植物的长期协同进化过程中形成互惠共存、相互制约的和谐关系。内生微生物决定着宿主植物的健康、生长发育以及次生代谢等，并赋予其更广泛的环境适应能力［9］。同时，植物自身的基因型也能够影响植物内生微生物的多样性［10］。Walitang等［11］发现水稻自身的基因型是影响其种子内生细菌组成的重要因素。在对甘蔗属不同种和品种根系内生细菌的多样性研究中，Dong等［12］发现4个甘蔗属和2个甘蔗栽培品种内生细菌的群落多样性和丰富度呈现出显著 不同。

在甘蔗微生物与RSD互作关系的研究中，杨尚东等［1，13］比较了RSD感病与非感病植株根际和根系内生细菌的群落结构，结果显示相较于未感病植株，RSD感病植株根际细菌和根系内生细菌优势菌群的丰度和排位顺序发生了显著变化，这种细菌多样性的显著下降、特有内生细菌优势菌属和菌种数量减少是甘蔗植株抗病性降低的重要原因。目前，有关蔗茎内生真菌和细菌的多样性与甘蔗抗感RSD是否存在关联还未见相关研究报道。为此，本研究采用Illumina Miseq高通量测序平台，通过对不同抗感RSD甘蔗品种蔗茎内生真菌和细菌组成结构和多样性的分析，旨在揭示内生真菌和细菌在甘蔗抗病中的作用，从而为构建生态防控RSD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样地概况 采样地位于广东省韶关市翁源县官渡镇东三村甘蔗试验基地（24°16′59″N，113°56′24″E），该区域属于大面积甘蔗种植区。供试甘蔗品种均于2017年4月份种植于试验基地，按照常规大田管理措施进行栽种。

1.1.2 样品采集 2020年10月中旬在甘蔗生长期的末期分别采集宿根矮化病高感品种粤糖60（YT60）和抗病品种HoCP95988宿根3年的蔗茎［4，14］。选取的植株应为无任何病虫害危害症状，用经75%酒精消毒后的砍刀砍取距地面50 cm的蔗茎，表面消毒后去除蔗茎外皮，将茎内组织放入无菌的自封袋中，置于低温采样箱带回实验室，-80℃冷冻保存，用于DNA提取和高通量测序。每个品种按照五点取样法取5株蔗茎，共计10个样品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR扩增及高通量测序 采用FastDNA®Spin Kit按照说明书进行蔗茎总DNA的提取，每个品种包括5个重复蔗茎DNA。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度。对内生细菌16S rRNA 基因V5-V7区进行PCR扩增，引物 为799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1193R（5′-ACGTCATCC CCACCTTCC-3′）；对内生真菌rDNA ITS1区进行PCR扩增，引物为ITS1F（5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS1R（5′-G- CTGCGTTCTTC ATCGATGC-3′）。PCR扩 增 体 系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，正、反向引物（10 umol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。PCR反应条件：98℃ 2 min；98℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用QIA DNAMicroKit（QIAGEN公司）回收目的条带产物。委托上海派森诺生物科技有限公司使用Illumina Miseq高通量测序。

1.2.2 数据处理及分析 利用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行双端（Paired-end）测序，测序原始数据采用DADA2方法［15］进行去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体等步骤，产生的每个去重的序列ASVs（amplicon sequence variants）用于后续分析。细菌和真菌分别选用Greengenes 和 UNITE数据库进行物种分类学注释。基于序列物种分类学注释的结果，获得每个样本中真菌和细菌群落在各分类水平的具体组成；使用软件QIIME2（2019.4）分析微生物群落的Alpha多样性。

2 结果

2.1 蔗茎内生真菌和细菌群落测序数据及其多样性指数

2.1.1 测序数据 通过对2个品种10个蔗茎样品进行16S rRNA 基因和ITS基因的高通量测序，分别获得1 121 670和995 478条有效序列（表1）。其中，感病品种YT60蔗茎内生真菌的有效序列高于抗病品种HoCP95988，而内生细菌有效序列少于品种HoCP95988。品种YT60蔗茎内生细菌和真菌分别有3 061和176个ASVs，HoCP95988蔗茎内生细菌和真菌的ASVs仅有1 365和96个。

2.1.2 Alpha多样性分析 Alpha多样性提供了样本内微生物群落的丰富度和多样性信息。为了能全面地评估蔗茎内生细菌和真菌群落的多样性，本研究对供试样本的Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指数进行了比较，结果详见表1。感病品种YT60内生细菌的 Chao1和Observed species指数显著高于抗病品种HoCP95988（P＜0.05），但Shannon和Simpson指数无显著差异。内生真菌群落的多样性指数分析显示：两个供试品种的Shannon和Simpson指数存在显著性差异（P＜0.05），且感病品种YT60的多样性指数明显高于抗病品种HoCP95988。

表1 不同甘蔗品种蔗茎内生真菌和细菌测序数据、分类单元及多样性指数Table 1 Sequencing data, ASVs and diversity index of endophytic fungi and bacteria in the stalks of different sugarcane cultivars

2.2 蔗茎内生真菌和细菌类群组成分析

2.2.1 内生细菌类群组成分析 蔗茎内生细菌群落在门水平上的组成和丰度如图1-A所示。在门的分类水平上，2个品种蔗茎样品共检测到17个细菌门。内生细菌主要分布在变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes、异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus、拟杆菌门Bacteroidetes，其中变形菌门为最优势菌门，占比86.2%-92.7%。同一生境下抗感病品种蔗茎内生细菌门的相对丰度不同，放线菌门和芽单胞菌门Gemmatimonadetes的相对丰度在YT60（8.36%和1.15%）中明显高于HoCP95988（1.69%和0.003%），而异常球菌-栖热菌门在YT60（0.22%）中的相对丰度却低于HoCP95988（2.54%）；此外，仅在感病品种YT60中检测到浮霉菌门（Planctomycetes）。在属分类水平上，水小杆菌属Aquabacterium（11.06%-13.86%）、柄 杆 菌 属Caulobacter（6.22%-11.22%）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（5.59%-16.05%）、新鞘脂菌属Novosphingobium（2.48%-2.60%）在供试品种中均有较高的相对丰度（图2-A）。同时，发现放线杆菌属Actinobacillus在抗病品种HoCP95988中为优势属（9.99%）。

2.2.2 内生真菌类群组成分析 甘蔗蔗茎内生真菌群落在门水平上的组成和丰度如图1-B所示。在真菌门分类水平上，2个品种蔗茎内生真菌主要的门有子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）。其中子囊菌门占主导地位，占真菌总数的77.4%-80.9%，其次为担子菌门，占比为10.2%-14.8%。此外，感病品种YT60单独检测到Rozellomycota、壶菌门（Chytridiomycota）、芽枝霉门（Blastocladiomycota）。在真菌的属分类水平上（图2-B），拟青霉属Simplicillium（14.35%-18.78%）、曲霉属Aspergillus（6.92%-12.97%）和马拉色菌属Malassezia（5.74%-6.70%）在2个样品中均有较高丰度。但是，不同抗感病品种中真菌属的丰度出现差异，如链格孢属Alternaria在抗病品种HoCP95988中为优势属，占比18.78%；而腐质霉属Humicola和镰刀菌属Fusarium在感病品种YT60中有较高丰度，占比分别为13.12%和7.96%。

图1 不同甘蔗品种蔗茎内生细菌（A）和真菌（B）菌群门分类水平结构组成Fig. 1 Dominant phyla detected from endophytic bacterial（A）and fungal（B）community in the stalks of different suga-rcane cultivars

图2 不同甘蔗品种蔗茎内生细菌（A）和真菌（B）菌群属分类水平结构分布图Fig. 2 Dominant genera detected from endophytic bacterial（A）and fungal（B）community in the stalks of different sugarcane cultivars

2.3 蔗茎内生真菌和细菌群落物种差异分析

维恩图（Venn）可以直观地表现不同样品间微生物群落ASVs 数目组成相似性、重叠情况以及特异性。根据抗感病甘蔗品种蔗茎细菌和真菌的ASVs绘制Venn图，结果如图3所示：品种YT60和HoCP95988蔗茎内生细菌中共有的ASVs为247个，占全部ASVs的5.91%；蔗茎内生真菌的共有ASVs为24个，占比9.72%；2个品种的蔗茎细菌和真菌中各自特有的ASVs均超过90%。以上数据表明，宿根矮化病抗感病品种的蔗茎内生真菌和细菌类群存在明显差异。

图3 不同甘蔗品种蔗茎内生细菌（A）和真菌（B）ASV维恩图Fig. 3 ASV Venn diagram of endophytic bacteria（A）and fungi（B）in the stalks of different sugarcane cultivars

LEfSe（LDA Effect Size）分析可以直接对所有分类水平同时进行差异分析，并从分组之间找到稳健的差异物种。抗感病甘蔗品种蔗茎内生细菌LEfSe分析结果如图4所示：供试品种在浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和软壁菌门（Tenericutes）的4个门、33个科和34个属的物种组成上存在显著差异。在差异物种中，仅有柄杆菌目（Caulobacterales）中的柄杆菌科（Caulobacteraceae）在抗病品种HoCP95988有较高丰度，其余的物种均在感病品种YT60呈现较高丰度。然而，与蔗茎细菌群体组成差异不同，蔗茎真菌的物种组成在2个品种间仅有一个分类单元（粪壳菌目Sordariales）表现出显著差异，且该分类单元在YT60中具有较高丰度。

图4 不同甘蔗品种间蔗茎内生细菌LEfSe分析的物种分类学分枝图Fig. 4 LEfSe cladogram of endophytic bacteria in the stalks of different sugarcane cultivars

3 讨论

植物内生微生物是植物微生态系统中必不可少的组成部分，其与寄主植物在长期的共同进化中，形成了紧密的共生关系，在促进植物生长、增强植物抗逆能力、调节寄主体内微生态平衡等方面发挥着重要作用［16］。已有研究表明，植物生长的环境条件（季节变化、地理位置、栽培措施等）、不同组织器官（根、茎、叶、花、果实等）、寄主的基因型、发育阶段、健康状态和功能性状等对植物内生微生物的菌群组成和多样性会产生重要影响［17-19］。苹果树枝条、叶片［20］和梨果实［21］内生细菌的种群组成和功能在品种间存在较大差异。同时，研究表明植物的抗病性是驱动内生微生物群落变化的重要因素。Kiani等［22］通过常规的分离培养方法研究了条锈病抗感小麦品种根、茎和叶部内生细菌的组成，发现抗、感病品种间内生细菌数量差异显著，抗病品种丰度高于感病品种。采用高通量测序技术对大斑病抗、感玉米品种叶际细菌群落组成的分析显示，抗病品种细菌多样性指数高于感病品种，且品种间细菌群落组成差异显著［23］。针对不同抗感病特性的甘蔗品种与其内生微生物之间的互作关系却较少受到关注。本研究利用 Illumina Miseq 高通量测序技术分析了RSD抗感病甘蔗品种内生细菌和真菌的多样性和群落组成，发现甘蔗的抗病表型能够影响蔗茎内生细菌和真菌群落的丰富度和多样性；与抗感病小麦、玉米品种内生细菌群落组成差异表现不同，RSD感病品种YT60的内生细菌和真菌多样性指数高于抗病品种HoCP95988，具有更为复杂的物种组成。然而，在样品选择中本研究只关注了生长健康的抗感病品种内生细菌和真菌组成的多样性和差异，并未比较RSD侵染后不同品种内生细菌和真菌群落组成变化特征。Ginnan等［24］分析了黄龙病引发的柑橘叶、茎秆和根组织细菌和真菌的多样性和组成，结果显示柑橘核心微生物菌群和群落多样性受到病菌侵染的不同时期和病害发生严重程度的影响。那么，宿根矮化病菌的侵染如何影响甘蔗茎部内生微生物的组成将是下一步研究内容之一。

已有较多研究关注了甘蔗根际和根系内生细菌的多样性及其功能性菌株的开发和利用［12，25］，但是对甘蔗蔗茎内生微生物群落多样性的分析还相对较少。本研究对2个甘蔗品种蔗茎内生细菌多样性进行的比较分析显示，变形菌门为优势菌群，分别覆盖了供试品种内生细菌的86.2%-92.7%，表明在门分类水平上蔗茎内生细菌群体组成相似。这与甘蔗根系内生细菌组成的研究结果基本一致［1］。在属级分类水平上，蔗茎内生微生物种类较多，感病品种的多样性较抗病品种丰富，优势菌群存在较大差异。抗病品种HoCP95988内生细菌中有较多鞘氨醇菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、假单胞菌属等具有抑菌作用、促生活性和抗逆功能的类群［26-28］。RSD病原菌所属的赖氏菌属Leifsonia在感病品种YT60的健康蔗茎中有较高丰度，这符合宿根矮化病无症状带菌的特性［29］。有关甘蔗内生真菌的组成一直未见报道。本研究基于ITS区的分析较为全面的描述了蔗茎内生真菌的组成：子囊菌门和担子菌门为优势菌门；拟青霉属、曲霉属、链格孢属、镰刀菌属和马拉色菌属等在属水平具有较高丰度。以上研究结果将为进一步分离和挖掘对甘蔗病菌具有拮抗和抗病功能菌株提供了线索。

本研究采用高通量测序技术分析了宿根矮化病抗感品种蔗茎内生细菌和真菌的多样性和种群组成。在今后的研究工作中，将进一步分析不同抗病水平、不同发育阶段以及不同种属甘蔗资源内生微生物群落组成和变化与宿根矮化病菌的互作关系。这些研究将有助于更为全面地揭示内生微生物与甘蔗抗病性之间的关系，从而为RSD的生态防控提供理论基础。

4 结论

宿根矮化病抗感2个甘蔗品种茎部内生细菌和真菌的多样性较为丰富，感病品种YT60 Alpha多样性指数高于抗病品种HoCP95988。抗感病品种间茎部内生细菌和真菌的类群明显不同，主要菌群的组成和丰度存在显著差异，部分优势菌群丰度的差异可能在一定程度上影响了甘蔗对宿根矮化病的抗性。差异物种的分类信息为宿根矮化病生防菌的挖掘和利用提供了依据。