氧化石墨烯对拟南芥生长的促进作用

2022-07-22高聪萧楚健鲁帅王苏蓉袁卉华曹云英

生物技术通报 2022年6期

高聪萧楚健鲁帅王苏蓉袁卉华曹云英

（南通大学生命科学学院，南通 226019）

纳米材料具有优异的光学、电学、力学特性，在材料学、微纳加工、能源、生物医学和药物传递等方面具有广阔的应用前景［1］。石墨烯是目前常用的一种碳纳米材料。氧化石墨烯（GO）是石墨烯的氧化物，也是一种碳纳米材料，因其含氧官能团增多而使其性质较石墨烯更加活泼。

碳纳米材料已拓展至农业，它能影响植物生长和发育的过程及其生长的环境［2-5］。研究表明，它对植物生长有促进作用。如石墨烯碳纳米材料能促进植物呼吸和根系生长，减少氨的挥发，提高产出率、保障安全生产等［6］。在肥料中添加石墨烯碳纳米材料能提升肥料利用率、促进种子发芽和农作物生长［7］。但是，也有纳米材料抑制植物生长等负面影响的报道。如一定浓度的纳米材料可降低发芽率、抑制植物生长甚至导致植物枯萎死亡；抑制蛋白质合成和细胞分裂甚至导致植物基因水平的损伤，对植物造成毒性效应［8］。还有研究报道纳米材料对植物生长的影响效果和处理浓度之间关系密切，不同浓度的处理可能产生截然不同的结果［6-9］。

目前，纳米材料对植物生长影响的研究还处在初始阶段，许多结论还不完善和统一，GO在植物方面的报道更少。拟南芥是一种模式植物，其生长周期短。本研究选用GO纳米材料，设置不同GO浓度培养拟南芥，测定其主根长和侧根数等形态指标，以明确其影响效果与GO处理浓度的关系，确定促进生长的最适宜浓度。进一步分析拟南芥幼苗中超氧阴离子自由基（O2·-）的产生、超氧化物歧化酶（SOD）活性和根系活力等生理指标，再分析其对拟南芥根生长相关的基因表达情况，进一步明确纳米材料GO对植物生长的影响及其内在机制，为其应用于农业生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为拟南芥野生型（Col-0），种子用70%乙醇和20%漂白剂进行表面消毒，无菌水清洗后将其点在方形培养皿（10 cm×10 cm）中萌发（灭菌的1/2 MS固体培养基，含有0.8%琼脂和1%蔗糖）。将10 g氧化石墨烯（GO）粉末溶解于1 L去离子水中，并灭菌。将超声处理1 h的GO溶液与灭菌的1/2 MS培养液混合，形成GO浓度分别为0、20、50、100和200 μg/mL的培养基（下文简称GO/MS培养基）。在各培养基上分别播种30-40粒种子，重复3次，4℃放置2 d，然后转至20℃/22℃，16 h（昼）/8 h（夜）的光周期和100 μmol/（m2·s）的光照强度下的人工气候室（全友，南京）中生长。

1.2 方法

1.2.1 GO的形貌表征首先在扫描电子显微镜样品台上贴好导电胶，然后将干燥好的GO贴在导电胶上，在电流约为4 mA条件下将样品喷金30-40 s。在15 kV加速电压下，用扫描电子显微镜（SEM，ZEISS Gemini SEM 300）观察GO的表面形态，并拍照。

将GO分散到水中，超声分散30 min，取5 μL滴加到镀有碳膜的铜网上，自然风干后用透射电子显微镜（TEM，Talos F200X）观察GO纳米结构。

通过傅里叶红外光谱法（FTIR，TENSOR 27红外光谱仪）对GO进行表征。FTIR测定红外光谱波数范围为500-4 000 cm-1。

1.2.2 主根长和侧根数的观察对生长在不同浓度GO/MS培养基中6 d的拟南芥植株进行拍照，并使用ImageJ 1.53软件测量主根长。对生长11 d的拟南芥植株进行拍照（为便于保存，拍摄时已通过2.5%戊二醛固定），并人工统计其侧根数。

1.2.3 主根根尖各部分大小的分析对生长在不同浓度GO/MS培养基中4 d的拟南芥主根进行碘化丙啶（propidium iodide，PID）染色，用激光共聚焦显微镜（Leica，SP8）拍摄其根部的不同区域，再用ImageJ 1.53软件测量分生区、伸长区、根尖直径和根冠大小。

1.2.4 O2·-、SOD活性和根系活力的测定采用四硝基氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）和氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC）染色法分别进行O2·-和根系活力的测定，所有的样品均处理6 d。O2·-的测定是将拟南芥幼苗放在含1% NBT的20 mmol/L磷酸钾缓冲溶液中，抽真空后用蒸馏水洗去染液，用70%乙醇溶液90℃脱色20 min，然后用立体显微镜（Leica，S8AP0）观察并拍摄，拟南芥幼苗着色的深浅来表示O2·-产生的多少。根活力的测定是将根浸在2%TTC染液中，37℃放置5 h，立体显微镜观察并拍摄。根着色深浅表示根活力的高低。采用WST法测定SOD活性，样品的提取及测定参照试剂盒（建成，南京）的说明书来进行。

1.2.5 根生长相关基因表达以生长在1/2 MS（含有GO浓度为0和50 μg/mL）培养基中的拟南芥为基因表达分析材料，分别选取6及11日龄的拟南芥用于分析其主根和侧根生长相关基因的表达。样品经液氮研磨，用TRIZOL法提取总RNA，利用cDNA合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。以ACT2（At3g18780）为内参基因，参照Cao等［10］方法，通过荧光定量PCR分析其基因表达水平，具体引物序列见表1。

表1 荧光定量表达分析用的引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescence quantitative expression analysis

1.2.6 统计分析采用SPSS20.0和origin进行统计分析和作图。采用Ducan检验法统计差异。试验重复3次。

2 结果

2.1 GO的表征

从图1-A可以看出，GO呈膨胀状态，由多个片层叠加而成，表面显示有褶皱，原因主要是多层GO叠加之后及自然状态下单层GO为保证状态的稳定而自动成为褶皱结构。超声后的GO以单片层或少数几层叠加的形式存在（图1-B），其特征峰出现在波长3 237（O-H的伸缩振动）、1 712（酯C=O的伸缩振动）和1 041 cm-1（C-O的伸缩振动），均为GO的含氧官能团（图1-C）。

图1 GO的表征图Fig.1 Characterization of GO

2.2 不同GO处理浓度对拟南芥生长的影响

不同浓度GO培养拟南芥6 d后，与对照相比，经GO处理的拟南芥主根长均明显增长，分别提高了4.6%、43.0%、31.7%和30.5%（图2），其中，经50 μg/mL GO浓度处理的拟南芥主根最长，约为26.5 mm（图2-A）。随GO处理浓度的增加，根长呈现有规律的变化，先升高，于50 μg/mL GO浓度时达到最高，随后又逐渐降低（图2-B）。表明GO对拟南芥主根的生长有促进作用，但作用效果与处理浓度有关，适宜的浓度效果最好，过高或过低都会降低其效果。因此，促进拟南芥主根生长的GO适宜处理浓度约为50 μg/mL。

图2 不同浓度GO处理对拟南芥主根生长的影响Fig.2 Effects of different concentrations of GO on the taproot growth of A. thaliana

不同浓度GO培养拟南芥11 d后，观测其侧根的生长情况（图3）。与对照相比，200 μg/mL高浓度处理和20 μg/mL低浓度处理会抑制侧根数的形成，分别比对照减少了20.2%和24.0%；而50 μg/mL中等浓度处理却能够显著增加侧根数，约增加了27.1%；另外，100 μg/mL浓度处理则无显著变化。表明不同浓度的GO对拟南芥生长可能会产生促进、抑制和无效3种情况，在一定程度上解释了前人不同试验结论的原因，不同浓度处理可以产生完全不同的结果。和主根一样，促进侧根生长的适宜浓度约为50 μg/mL。

图3 不同浓度GO处理对拟南芥侧根生长的影响Fig.3 Effects of different concentrations of GO on the lateral root growth of A. thaliana

2.3 GO对拟南芥根系生长的促进作用

用50 μg/mL GO浓度培养拟南芥，测定其形态和生理生化等指标，进一步探讨GO促进根系生长的内在机制。

2.3.1 GO对拟南芥根区不同部位生长的影响 50 μg/mL GO浓度培养拟南芥4 d后，测量其根尖不同区域的长度，发现GO处理后的拟南芥主根分生区和伸长区的长度显著增加，但根尖直径和根冠长度并无显著变化（图4）。表明GO主要是通过分生区和伸长区而促进根系生长。

图4 不同浓度GO对拟南芥主根各部位的影响 Fig.4 Effects of different concentrations of GO on the different parts of taproot of A. thaliana

2.3.2 GO对拟南芥超氧阴离子自由基、SOD活性和根系活力的影响通过TTC和NBT对组织进行染色，进一步分析GO处理对拟南芥幼苗中的超氧阴离子自由基O2·-水平和根系活力造成的影响（图5）。TTC染色法是常用的鉴定根系活力的方法。在GO/MS培养基中生长6 d拟南芥的主根经TTC染色，发现50 μg/mL GO处理植株的颜色明显深于对照组，组织着色越深表明根系活力越强；反之，根系活力越弱。表明适宜的GO浓度可以提高拟南芥的根系活力。

经50 μg/mL GO处理的拟南芥幼苗颜色较浅（图5-C和图5-D），而对照植株的颜色相对较深。表明适宜的GO浓度处理提高了拟南芥幼苗中SOD的酶活性，从而减少了超氧阴离子自由基水平。

此外，通过WST法对SOD活性进行了定量分析，发现经50 μg/mL GO处理的拟南芥幼苗的SOD活性显著高于对照，其活性约增加43.6%（图5-E）。这印证了NBT的染色结果。

图5 不同浓度GO处理后拟南芥的组织染色及SOD活性的定量分析Fig.5 Tissue staining and SOD activity quantitative analysis of A. thaliana treated with different concentrations of GO

2.3.3 GO对拟南芥根生长相关基因表达的影响对不同浓度GO处理下拟南芥根相关基因的表达检测（图6）。与对照相比，ADC1和DAR2的表达量下调，而ERFII-1的表达量则变化不大，IQM3的表达量上调，且达到显著水平。表明在GO的影响下，可导致ADC1和DAR2下调和IQM3上调，进而促进了根长的增加。

图6 不同浓度GO处理对拟南芥根生长相关基因的表达Fig.6 Effects of different concentrations of GO on the gene expressions related to root growth in A. thaliana

与对照相比，侧根生长相关的基因ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表达量在GO处理后都表现为显著上调，分别增加了150.0%、51.0%、312.0%和83.0%，CKX1的表达量则没有明显改变。表明适宜浓度GO处理可使ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表达量上调，进而促进了侧根数量的增加。

3 讨论

3.1 不同GO浓度处理对植物生长的影响分析

本研究结果表明，在20-200 μg/mL浓度处理范围内，随着GO浓度的增加，对拟南芥主根长均表现为促进作用，20 μg/mL处理促进作用不明显，但随着浓度增加促进效果增强，到50 μg/mL时促进作用达到最大，然后随浓度升高促进效果下降，但50-200 μg/mL浓度促进作用均达到显著水平；GO对侧根生长的影响则是20 μg/mL低浓度处理和200 μg/mL高浓度处理均会抑制侧根数的形成，而50 μg/mL中等浓度处理却能够显著增加侧根数。如果将抑制作用理解为促进作用的负增长，则GO影响主根和侧根生长的浓度响应趋势非常类似，先是随着处理浓度升高而促进作用效果增加，达到一个峰值后浓度增加而其效果则下降。无论是主根还是侧根，50 μg/mL浓度处理促进生长的效果最好。本研究明确了GO处理对拟南芥生长的影响，但作用效果与处理浓度显著相关，不同的处理浓度可能会产生促进或抑制完全相反的2种效果。本研究中，GO处理对主根生长没有产生抑制效果，可能是由于浓度范围设置过窄，没有达到抑制主根生长的处理浓度，根据处理产生的效果趋势，如果继续增加处理浓度，很可能会出现抑制主根生长的处理效果，有待进一步试验验证。

Park等［9］也证实了GO可促进拟南芥的生长，但其试验浓度和效应与本研究结果不一致。认为GO浓度为0.1 μg/mL时可促进拟南芥叶面积的增加，在0.1-1.0 μg/mL范围内可促进开花的数量，但对根的长度没有影响。造成这种差异的原因可能是不同器官对GO处理的响应浓度不同，根系需要更高的浓度处理。Park等［9］的GO处理最高浓度仅为1.0 μg/mL，可促进花和叶的生长，却不能影响根的生长。本研究增加处理浓度，可以明显看到GO处理对根系生长的影响。所以，同一植物的不同器官对GO处理的响应浓度是不一样的。

GO对植物的影响，还与植物的种类有关，不同种类的作用效果和响应浓度不同。有研究表明，经5和50 mg/L的石墨烯处理的水稻根长与对照组并无明显差异，而在100和200 mg/L的处理中则表现为抑制，没有显示石墨烯处理对其生长的促进作用［11］。另有研究表明，10 μg/mL的GO处理促进了西瓜的生长，增加了其周长，并能增强植物的稳定性［9］，与本研究结果相比，促进西瓜生长的GO处理浓度要低。

3.2 GO促进植物生长的内在机制

本研究结果表明，50 μg/mL GO处理促进拟南芥根系生长的效果最好，因而在此浓度下对拟南芥进行处理，测定了形态和生理生化等指标，探讨GO促进植物生长的内在机制。

3.2.1 GO促进拟南芥根系生长的作用部位对GO处理的拟南芥的主根根尖的不同区域进行分析，发现根尖分生区和伸长区的长度显著增加，而根尖直径和根冠长度并无显著变化。表明GO主要影响了根尖分生区和伸长区的长度。但是拟南芥根系表型受多个因素的影响，根尖分生区和伸长区长度的增加只是其中一个外在表现，内在因素可能涉及根活性、根的抗氧化性或基因表达等，都可能成为影响拟南芥根长和侧根数变化的因素。

3.2.2 GO促进拟南芥根系生长的生理机制正常情况下，生物体内会生成O2·-，过量的O2·-会造成细胞损伤，SOD酶的作用可以清除O2·-，对维持机体氧化与抗氧化平衡具有重要意义，这也是评价植物体健康程度的重要指标。根是植物固定植株和吸收水分和养分的重要器官，根活力的高低是反映根系生长代谢旺盛的重要指标。本研究中经50 μg/mL GO处理的拟南芥，NBT染色后植物体的颜色与对照相比较浅，表示植物体产生的超氧阴离子自由基O2·-减少，即SOD的活性被提高，同时也对SOD进行了定量分析，结果与其一致；TTC染色后显示的颜色与对照相比较深，表示GO处理提高了其根系活力。这表明50 μg/mL GO处理对拟南芥的SOD酶活性和根系活力均起到提高的作用。有研究报道水稻经50-200 μg/mL的石墨烯处理，发现其SOD的活性逐渐提升，而在100-200 μg/mL的处理中根长则表现为抑制［11］。这与张鹏［12］和Paramo等［13］结论基本一致，都证明植物在低浓度GO下能增加SOD的活性，而高浓度GO会抑制SOD的活性。Zhang等［14］的研究也发现30 μg/mL银纳米颗粒会引起拟南芥活性氧的积累和光合作用的破坏。这也从另一方面反映，同一浓度石墨烯处理的同一作物所表现的影响不一致，即同一浓度可能对根长有积极影响，但是在其他的生理生化指标上却表现为消极影响。

3.2.3 GO促进拟南芥根系生长的分子机制外部环境因素改变后，植物除了生理机制受到影响，基因表达也会发生改变。根据前人研究，本实验选择了与根系发育相关的基因进行了表达分析，主要有影响根长的基因ADC1［15］和DAR2［16］，影响侧根的基因ARF7［17］、ARF19［17］和CKX1［18］及同时影响根长和侧根的基因ERFII-1［19］和IQM3［20］。在拟南芥中，ADC1可以影响多胺的合成，而多胺具有调节根长的作用［15］；DAR2可以与多种激素联合，进而影响根系分生组织的发育［16］；ERFII-1作为一种转录因子，也受到激素的调节，从而影响根的发育［19］；IQM家族属于具有IQ基序的钙调素结合蛋白家族，IQM3参与植物根系发育的调控［20］；ARF7/ARF19在生长蛋白介导的植物发育中发挥重要作用［17］；CKX1的过表达会引起芽生长发育不良、顶端优势下降和根生长增强［18］。

研究表明碳纳米材料是可以影响植物基因表达的，如GO通常通过氢键的形成和π-π堆积相互作用与细胞内的小分子结合，并以此影响基因的表达或其他生理生化效应［21-22］。根据基因表达情况，结合植物表型特征，有利于解释在碳纳米材料影响下植物体的调控方式。本研究结果表明，50 μg/mL GO处理后基因ADC1和DAR2表达下调以及IQM3的表达上调，从而促进了根长的增加；ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表达显著上调，从而促进了侧根数量的增加。值得注意的是，IQM3在根长和侧根的调控过程中均显著上调，而ERFII-1在侧根数的形成中作用比较大，表明IQM3和ERFII-1在对根系发育的调控中可能起着重要的作用。

GO对植物的影响是多方面的，且同一碳纳米材料处理在物种间的差异较大。虽然GO能促进植物生长，其对细胞的毒性仍然需要考证，包括GO对生物生命周期的影响、纳米材料转移对生态环境的影响等。想要应用于生产实践中仍需大量试验证明碳纳米材料安全性、可靠性和可行性，并探明GO对植物的作用机制。在本研究中，展示了GO对拟南芥生长的综合提升，适宜 GO 处理使主根根尖的分生区和伸长区长度增加，根系活力提高， SOD 活性增加使O2·-的产生减少，与激素、多胺相关影响根系生长的基因表达发生变化，从而促进根系的生长（图 7）。本研究确定了促进拟南芥生长的GO浓度，展现了GO应用于农业生产中的巨大潜力。