速效救心丸经ALKBH5/m6A调控自噬减轻缺氧/复氧心肌细胞损伤

王可妍，高俊杰，林文勇，王 丹，张春伶，牛振超，李益萍*，王肖龙*

(1.上海中医药大学附属曙光医院，国家中医心血管病临床医学研究中心分中心，上海 201203；2.上海中医药大学附属曙光医院心血管病研究所，上海 201203)

急性心肌梗死是发病率和死亡率很高的主要心血管疾病之一，其干预的最佳治疗手段是再灌注治疗。然而，在再灌注过程中会导致额外的心肌损伤，即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI)[1-3]。治疗MIRI的方法主要有机械性物理疗法(低温疗法、远隔缺血后适应等)及药物治疗(心房利钠肽、环孢霉素A等)，然而临床试验并未证实其确切疗效[4-6]。因此，MIRI成为研究的热点和难点。

MIRI发病机制复杂，自噬在其病理过程中发挥重要作用[7]。N6-腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)甲基化是RNA重要的表观遗传学修饰，m6A甲基化水平主要由甲基化酶如甲基化酶3 (methyltransferase-like 3,METTL3)和去甲基化酶如ALKBHB同源蛋白5 (alkylation repair homolog protein 5,ALKBH5)调控[8]。Song等[9]研究发现缺氧/复氧后 METTL3表达上调，m6A甲基化水平增加，进而损害自噬通量，促进心肌细胞凋亡，提示m6A甲基化修饰可能通过影响自噬从而参与MIRI的病理过程。

速效救心丸主要由川芎嗪、冰片组成。临床发现其可显著改善心肌梗死及心绞痛等症状[10-12]。本课题组预实验研究发现速效救心丸可以减少大鼠心肌梗死面积，改善心功能，从而减轻缺血再灌注损伤，并与自噬机制有关。本研究通过缺氧/复氧心肌细胞模型，从表观遗传学与自噬角度深入探讨速效救心丸对MIRI的保护作用，为其临床运用提供更加充分的理论依据。

1 材料

1.1 细胞 大鼠心肌细胞H9c2细胞购自上海诺百生物科技有限公司。

1.2 试剂与药物 速效救心丸(天津中新药业集团股份有限公司，批号617135)，其浓度的选择基于前期基础研究，分别用无水乙醇将速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片稀释溶解至50、100、25 mg/mL，与细胞共培养时使其给药终质量浓度为50、100、25 μg/mL。BCA蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、蛋白Marker、CellTiter-LumiTMSteady发光法细胞活力检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号0701018181104、P0012AC、061418181119、C0069S)；DMEM高糖培养基(美国Corning公司，批号32320006)；PBS (上海昱都生物科技有限公司，批号AF29526788)；0.25% Trypsin-EDTA[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，批号193154]；SYBR RT-qPCR Master Mix、RNA抽取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，批号Q341-02、7E552A1)；GoScriptTMReverse Transscription (美国Promega公司,批号0000389033)；ALKBH5(英国Abcam公司，批号ab195377)；GAPDH (美国Proteintech公司，批号051201)；二抗(合肥白鲨生物科技有限公司，批号69110200)；EpiQuik m6A RNA甲基化定量检测试剂盒(美国Epigentek 公司，批号P-9005)。

1.3 仪器 超净工作台(珠海市再鑫仪器有限公司)；Forma311型CO2细胞培养箱、StepOnePlus Real-Time PCR仪(美国Thermo公司)；SDS-PAGE电泳仪、湿转转膜仪(美国Bio-Rad公司)；5430R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 缺氧/复氧模型的建立及复氧时间的确定 H9c2细胞培养在含10%胎牛血清的高糖DMEM中，5% CO2培养箱中传代培养至第3代后建立缺氧/复氧模型。更换培养基为低糖无血清的DMEM，在缺氧条件下(1% O2、94% N2、5% CO2)培养2 h后再复氧(95%空气，5% CO2)，分别复氧0、2、4、6 h。

2.2 化学发光法检测细胞活力 通过CellTiter-LumiTMSteady发光法细胞活力检测试剂盒检测不同复氧时间组的ATP水平来确定最佳复氧时间。使用满足化学发光检测条件的96孔板，之后进行细胞铺板，5% CO2，37 ℃，过夜培养。室温平衡10 min，向每孔中加入发光法检测试剂，室温振荡2 min，室温孵育10 min，使发光信号趋于稳定。使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行检测。

2.3 实验分组 H9c2细胞铺板密度在30%～40%之间，随机分为常氧组、缺复/复氧组、速效+缺氧/复氧组、川芎嗪+缺氧/复氧组、冰片+缺氧/复氧组，药物预处理1 h之后进行缺氧/复氧处理，待到规定时间后收集细胞mRNA和蛋白。

2.4 Western blot检测ALKBH5的表达 提取各组细胞蛋白，BCA试剂盒蛋白定量后变性，上样、电泳、转膜，脱脂奶粉封闭，加入ALKBH5一抗(1∶2 000)，4 ℃过夜孵育，洗膜后加入二抗(1∶10 000)，室温孵育2 h，洗膜，显影。

2.5 Human ALKBH5过表达慢病毒制备 根据ALKBH5(NM_017758.3)基因信息，针对CDS区进行基因合成，并将其构建入慢病毒表达载体骨架PDS085_pL-MCS(用NheI和AscI酶切)中，即获得慢病毒表达载体pl-CMV-ALKBH5。

2.6 转染实验分组 H9c2细胞铺板密度在30%～40%之间，随机分为空白转染+常氧组、空白转染+缺氧/复氧组、空白转染+速效预处理+缺氧/复氧组、空白转染+川芎嗪+缺氧/复氧组、空白转染+冰片+缺氧/复氧组、ALKBH5过表达+缺氧/复氧组、ALKBH5过表达染+速效+缺氧/复氧组、ALKBH5过表达+川芎嗪+缺氧/复氧组、ALKBH5过表达+冰片+缺氧/复氧组。

2.7 慢病毒转染细胞 从培养箱中取出细胞，吸去旧培养基，将含病毒的培养液小心加入各孔中，放于CO2培养箱孵育4～6 h，吸去含病毒的培养液，PBS清洗细胞2～3次，最后加入适量培养液，过夜后观察细胞状态。

2.8 RT-qPCR检测相关基因的表达 采用RT-qPCR法对相关基因表达进行定量分析。用TRIzol试剂提取心肌细胞总RNA，逆转录获取cDNA，SYBR Green PCR Master Mix Kit 用于量化RNA水平，以β-actin作为内参，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.9 比色法检测m6A甲基化水平 提取样品RNA，每次反应的总RNA量可为100～300 ng，每个反应的最佳量为200 ng。制备缓冲液与溶液，与RNA结合，捕获m6A RNA，使用酶标仪检测信号，计算m6A的水平。

2.10 统计学分析 通过SPSS 25.0软件进行处理，符合正态性及方差齐性，组间比较采用单因素方差分析；不符合正态性和(或)方差齐性，组间比较使用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 H9c2细胞不同复氧时间对细胞活力的影响 如图1所示，不同复氧时间组的细胞活力均低于常氧培养细胞(P<0.01)；其中复氧4 h可以较好的恢复细胞活力。因此后续缺氧/复氧模型均采取缺氧2 h，复氧4 h。

注：与同一复氧时间常氧组比较，**P<0.01。图1 不同复氧时间心肌细胞活力

3.2 速效救心丸预处理对细胞状态的影响 如图2所示，常氧组细胞生长状态良好，死亡细胞较少；与常氧组比较，缺氧/复氧组细胞死亡增加(P<0.01)；速效救心丸、川芎嗪及冰片预处理可减少缺氧/复氧后心肌细胞的死亡，促进增殖(P<0.01)。

3.3 速效救心丸预处理对缺氧/复氧心肌细胞ALKBH5表达的影响 如图3所示，与常氧组比较，缺氧/复氧组细胞去甲基化酶ALKBH5的mRNA和蛋白表达升高，其中mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05),蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与缺氧/复氧组比较，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片预处理均可增加缺氧/复氧后心肌细胞ALKBH5 mRNA 和蛋白表达(P<0.01)。

3.4 速效救心丸预处理及ALKBH5过表达对缺氧/复氧心肌细胞m6A甲基化水平的影响 如图4所示，与缺氧/复氧组比较，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片预处理可降低m6A水平(P<0.01)，ALKBH5过表达处理后也可下调m6A水平(P<0.01)。

注：与常氧组比较，**P<0.01；与缺氧/复氧组比较，##P<0.01。图2 速效救心丸对缺氧/复氧后心肌细胞的影响

注：与常氧组比较，*P<0.05；与缺氧/复氧组比较，##P<0.01。图3 速效救心丸对ALKBH5表达的影响

3.5 速效救心丸预处理及ALKBH5过表达对缺氧/复氧心肌细胞活力的影响 如图5所示，与缺氧/复氧组比较，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片预处理可提高缺氧/复氧后心肌细胞的活力(P<0.01)；与缺氧/复氧组比较，ALKBH5过表达处理也可增加心肌细胞活力(P<0.01)。

3.6 速效救心丸预处理及ALKBH5过表达对缺氧/复氧心肌细胞自噬的影响 如图6所示，与常氧组比较，缺氧/复氧组心肌细胞GSK3β、Atg5、Beclin1、P62 mRNA表达均升高(P<0.01)，mTORmRNA表达降低(P<0.01)；与缺氧/复氧组比较，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片预处理可抑制GSK3β、Atg5、Beclin-1、P62 mRNA表达(P<0.01)，促进mTORmRNA表达(P<0.01)；与缺氧/复氧组比较，ALKBH5过表达也可抑制GSK3β、Atg5、Beclin-1、P62 mRNA表达，促进mTORmRNA表达(P<0.01)。

4 讨论

在心肌缺血再灌注过程中，自噬被明显激活，超过一定水平时会导致细胞功能障碍，从而发生自噬性细胞死亡[13-14]，因此，抑制过度自噬可能成为治疗MIRI的一个有效靶点。参与自噬调控的经典信号通路之一是GSK3β/mTOR通路，一些关键蛋白可直接或间接反映自噬过程[15-16]。Beclin 1是自噬起始阶段的关键调控分子，调控早期自噬小体的形成。微管相关蛋白轻链3蛋白(microtubulerassociated protein light chain 3 protein,LC3)是Beclin1蛋白的关键下游因子，是检测自噬发生的标志性蛋白。Atg5也参与自噬体的形成[17-20]。P62的主要功能是将被降解的细胞器运输至成熟的自噬体[21]。随着对表观遗传学的深入研究发现，m6A修饰与自噬密切相关。

注：与空白转染+常氧组比较，**P<0.01；与空白转染+缺氧/复氧组比较，##P<0.01；与ALKBH5过表达+缺氧/复氧组比较，&&P<0.01。图4 速效救心丸与ALKBH5过表达对心肌细胞m6A甲基化水平的影响

注：与空白转染+常氧组比较，**P<0.01；与空白转染+缺氧/复氧组比较，##P<0.01；与ALKBH5过表达+缺氧/复氧组比较，&&P<0.01。图5 速效救心丸与ALKBH5过表达对心肌细胞活力的影响

注：与空白转染+常氧组比较，**P<0.01；与空白转染+缺氧/复氧组比较，##P<0.01；与ALKBH5过表达+缺氧/复氧组比较，&&P<0.01。图6 速效救心丸与ALKBH5过表达对心肌细胞自噬的影响

本课题组发现，速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片可有效改善缺氧/复氧心肌细胞损伤；缺氧/复氧后心肌细胞去甲基化酶ALKBH5 mRNA表达略增加，蛋白表达差异无统计学意义；而速效救心丸及其有效成分川芎嗪、冰片预处理可增加去甲基化酶ALKBH5的表达，下调m6A甲基化水平；抑制GSK3β、Beclin-1、Atg5、P62的表达，增加mTOR的表达。采用慢病毒转染技术使去甲基化酶ALKBH5过表达，ALKBH5过表达后缺氧/复氧心肌细胞m6A甲基化水平下降、细胞活力增加，GSK3β、Beclin-1、Atg5、P62的表达下降，mTOR的表达增加，表明速效救心丸可能通过ALKBH5/m6A途径抑制过度自噬从而减轻缺氧/复氧心肌细胞损伤。此外，本课题组发现速效救心丸拮抗缺血再灌注损伤的作用优于单体川芎，弱于单体冰片，提示速效救心丸减缓缺血再灌注损伤主要是通过冰片发挥作用，其用量较少，且在药物服用安全范围内，故对人体无害。

然而，本实验并未在蛋白层次上探索自噬相关指标的变化，其中LC3相对mRNA表达结果无统计学意义，故在以后的研究中应通过Western blot等技术来深入对自噬通路的研究。另外，应增加干扰ALKBH5表达后对缺氧/复氧心肌细胞的影响，以期为速效救心丸治疗MIRI提供更加充足的证据。MIRI目前尚无有效的治疗方法，但研究发现我国传统中药，如五参顺脉胶囊、三七总皂苷等通过抑制过度自噬减轻缺血再灌注损伤[22-25]，未来需要更多相关研究来推动我国传统中医药卫生事业的发展。