甘青青兰质量标准的研究

范莹莹马青青杨凤梅张炜骆桂法

（青海省药品检验检测院，青海省中藏药现代化研究重点实验室，国家药品监督管理局中药藏药质量控制重点实验室，青海 西宁810016）

甘青青兰又名“唐古特青兰”“陇塞青兰”，是藏医习用药，常用于治疗肝炎、胃炎、黄水类病，为唇形科植物甘青青兰Dracocephalum tanguticumMaxim 的干燥地上部分，始载于《四部医典》，生长在海拔3 000～4 600 m 的河谷阶地、荒坡草滩、灌丛林缘，产于西藏东部、青海和甘肃西南部，四川西部［1-3］，主要有黄酮、萜类、多糖、无机元素、挥发油等成分［4-6］，具有抗缺氧、抗菌、抗病毒、降血糖等作用［7-12］，作为藏族民间常用药大多入丸、散剂，常用相关品种有大月晶丸、秘诀清凉散、二十六味通经胶囊等，临床上还用其花季鲜全草提取的精油外涂加穴位按摩，用于亚健康的赤巴症调理。但现行标准（《卫生部药品标准》 1995 年版藏药第一册）中甘青青兰项下仅有基原、性状、鉴别项，专属性不强，缺乏必要的定量控制指标，无法有效控制药材质量，目前也鲜有相关报道。因此，在参考甘青青兰及其近似种研究的基础上，本实验建立了该药材定性鉴别和定量测定方法，可为其整体质量控制提供科学依据。

1 材料

Linomat 5 半自动薄层点样仪（瑞士卡玛公司）；LC-20A 高效液相色谱仪，配置PDA 检测器（日本岛津公司）；E2695 型高效液相色谱仪，配置2998PDA 检测器（美 国 Waters公司）；PURELAB Ultra Mk2 型纯水仪（威立雅水处理技术有限公司）；AR5120 型电子天平（美国奥豪斯公司）；AUW220D 型电子天平（日本岛津公司）；DT1028 CH 超声波提取器（德国Bandelin 公司）。聚酰胺薄膜（浙江台州四甲生化塑料厂）；Silica gel 60 型高效硅胶薄层层析板（德国Merck 公司）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂或自制）。甘青青兰对照药材（批号121529-201102）、齐墩果酸对照品（批号110709-201607）、绿原酸对照品（批号110753-201817，纯度96.8%）均购自中国食品药品检定研究院；胡麻素-6-O-葡萄糖苷对照品（纯度≥98%）由中国科学院西北高原生物研究所研制并提供。本实验从青海、甘肃、西藏、四川各地采集甘青青兰共18批，经西北高原生物研究所卢学峰教授鉴定为正品。乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 TLC 定性鉴别

2.1.1 齐墩果酸 取甘青青兰药粉约1 g，加入10 mL 无水乙醇，超声处理30 min，滤过，滤液通过活性炭小柱，浓缩至约2 mL，作为供试品溶液；取甘青青兰对照药材1 g，同法制备对照药材溶液；取齐墩果酸对照品约5 mg，精密称定，无水乙醇制成每1 mL 含1 mg 该成分的溶液，作为对照品溶液。吸取以上3 种溶液各5 μL，点样于gel 60 型高效硅胶薄层色谱板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（14∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，10%硫酸乙醇溶液显色，加热至斑点清晰后在紫外灯（365 nm）下检查，结果见图1。由此可知，在甘青青兰对照药材、齐墩果酸对照品相应位置上，各批样品均显示相同的橙红色荧光斑点。

图1 齐墩果酸TLC 色谱图Fig.1 TLC chromatogram of oleanolic acid

2.1.2 绿原酸 取甘青青兰药粉约0.5 g，加入20 mL 甲醇，超声处理30 min，滤过，蒸干滤液，加2 mL 甲醇溶解残渣，作为供试品溶液；再取0.5 g 甘青青兰对照药材，同法制备对照药材溶液；取绿原酸对照品约5 mg，精密称定，甲醇制成每1 mL含1 mg 该成分的溶液，作为对照品溶液。吸取上述3 种溶液各1 μL，点样于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸（30∶5∶5∶20∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯（365 nm）下检视，结果见图2。由此可知，在与甘青青兰对照药材、绿原酸对照品相应位置上，各批样品均显示相同的蓝色荧光斑点。

图2 绿原酸TLC 色谱图Fig.2 TLC chromatogram of chlorogenic acid

2.2 HPLC 定量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 Waters XBridge C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脱（0～20 min，95%～85% B；20～25 min，85%～82% B；25～50 min，82%B）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长325 nm，色谱图见图3。理论塔板数按绿原酸峰计，不低于3 000。

图3 各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷对照品适量，50% 甲醇制成每1 mL分别含两者233.3、207.7 μg 的贮备液，取适量，50% 甲醇制成每1 mL 分别含两者116.6、83.1 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取甘青青兰粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入50 mL50%甲醇，超声（功率200 W、频率40 kHz）处理30 min，50% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液 2、4、10、12、16、20 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积积分值（Y）对进样量（X）进行回归，得绿原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷方程分别为Y＝3.067×106X＋5.962×103（r＝0.999 9）、Y＝1.976×106X-3.669×104（r＝0.999 9），分别在0.23～2.33、0.17～1.67 μg 范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液10 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得绿原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷峰面积RSD 分别为0.2%、0.1%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液（1 号）10 μL，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得绿原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷峰面积RSD 分别为0.2%、0.3%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取同一批本品（1 号）6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得绿原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷含量RSD 分别为0.6%、0.4%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 耐用性试验 选择沃特世e2695 高效液相色谱 仪（Agilent Extend C18色谱柱，4.6 mm ×250 mm，5 μm）、安捷伦高效液相色谱仪（Agilent ECLIPSE XDB C18色谱柱，4.6 mm × 250 mm，5 μm）、岛津LC20AT 高效液相色谱仪（Waters XBridge C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm），在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。结果，供试品溶液中各成分色谱峰的峰形对称，分离度良好，可满足实验要求。

2.2.9 加样回收率试验 取各成分含量已知（绿原酸8.92 mg／g、胡麻素-6-O-葡萄糖苷8.30 mg／g）的甘青青兰粉末6份，每份约0.25 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入含绿原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷0.045 48、0.041 02 mg／mL 的50%甲醇50 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，计算回收率，结果见表1。

表1 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.1 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.2.10 样品含量测定 取18 批甘青青兰，每批2份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，外标法计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（n＝2）Tab.2 Results of content determination of various constituents（n＝2）

3 讨论

3.1 TLC 定性鉴别 本实验选择甘青青兰中的萜类化合物齐墩果酸、苯丙素类化合物绿原酸作为指标成分，固定相分别采用硅胶G 薄层板、聚酰胺薄膜，还增加了对照药材，可提高TLC 法专属性。同时，分别采用不同厂家生产的硅胶G 薄层板、聚酰胺薄膜，在不同温度、相对湿度下进行耐用性实验，发现不同条件下上述2 种成分均得到较好的分离，主斑点清晰，Rf值适中。

3.2 HPLC 定量测定 本实验选择绿原酸、胡麻素-6-O-葡萄糖苷作为指标成分，其中前者具有抗菌、抗病毒、降脂、降糖、保护心血管等作用［13-16］，与甘青青兰药效相关，是药材有效成分，而后者相关文献报道较少。结果，绿原酸含量在0.57%～2.48%范围内，平均1.32%；胡麻素-6-O-葡萄糖苷含量在0.01%～2.07% 范围内，平均0.72%，由于后者地域差异明显，药理作用不明确，故不建议列入甘青青兰质量标准草案。另外，由于梯度洗脱耗时、不环保，故采用等度洗脱对绿原酸含量进行测定，并规定其限度为按干燥品计算，不得低于1.0 %。