高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜中的4种甜味剂

周慧敏

（大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁大连116630）

甜味剂是赋予食品甜味的一种食品添加剂[1]。目前甜味剂种类很多，按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。常见的人工合成甜味剂有阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、纽甜和三氯蔗糖等。其中阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠、甜蜜素也属于功能性高倍甜味剂，也叫非营养性甜味剂，其甜度均为蔗糖甜度的10倍以上。这几种甜味剂因甜度高、用量少，常使用于糕点、酱腌菜、饮料、调味品和配制酒等食品中。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760－2014）明确规定了各种人工合成甜味剂在各类食品中的使用限量，但人工合成甜味剂在新鲜蔬菜上是不得使用的。人工合成甜味剂在限量范围内使用是安全的，但若长期过量使用会对人体产生一定危害[2]。

目前，甜味剂的检测方法有液相色谱法[3]、液相色谱-质谱[4]、离子色谱法[5]、气相色谱法[6]和气相色谱—质谱法，但没有蔬菜中多种甜味剂的检测方法。本文选择了阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠和甜蜜素4种典型的功能性高倍甜味剂，建立检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱纯），甲酸（色谱纯），实验用水为超纯水。阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠和甜蜜素均为1 000 μg/mL。

1.2 仪器与设备

Agilent 6495 液相质谱联用仪（美国Agilent公司）；Centrifuge 5804 R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Milli-Q 超纯水处理系统（德国Merck公司）；T18 均质机（德国IKA公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

称取样品约2 g置于50 mL离心管中，加入20 mL超纯水后用均质机匀浆，10 000 r/min 离心5 min，上清液过0.2 μm微孔水相滤膜后收集于进样瓶中，待上液质联用仪检测，进样量2 µL。

1.3.2 标准溶液的配制

分别移取1 000 μg/mL的阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠和甜蜜素100 μL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得到1 μg/mL的混合标准储备液。用水将混合标准储备液逐级稀释得到1 ng/mL、5 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的混合标准溶液。混合标准溶液直接进样，进样量2 µL。

1.3.3 样品测定

（1）色谱条件。色谱柱：Poroshell 120EC-C18；柱温：室温；流动相：A为超纯水（含0.1%甲酸），B为甲醇；液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

（2）质谱条件。电离方式ESI-，监测模式MRM，离子源温度200 ℃，离子喷雾电压3 000 V，各组分定性定量离子对等参数，见表2。

表2 各组分的质谱检测参数及液相保留时间

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

将1 μg/mL的混合标液，利用针泵进样，找到各组分母离子和子离子以确定MRM离子对，优化碰撞能，结果见表2。确定最优质谱检测条件后进一步优化液相色谱条件，色谱柱：Poroshell 120EC-C18；柱温：室温；流动相：A为超纯水（含0.1%甲酸），B为甲醇；流速：0.3 mL/min；液相色谱梯度洗脱程序见表1。仪器条件优化后目标化合物离子色谱图见图1，各组分达到完全分离，满足实验条件。

图1 目标化合物总离子色谱图

2.2 标准曲线及定量限

2.2.1 标准曲线

按1.3.2的方法配制标准序列浓度，以1.3.3的仪器条件进样。在1～100 ng/mL选定的质量浓度范围内，用各组分的峰面积对质量浓度作图，得到线性相关系数和线性方程，将40 ng/mL浓度的混合标准溶液连续进样6次的峰面积计算相对标准偏差，结果见表3。

表3 4种甜味剂保留时间、线性范围、相关系数、相对标准偏差

2.2.2 方法定量限

选一空白样品，按1.3.1实验步骤做加标回收实验，添加浓度从0.1 mg/kg逐渐稀释，当添加水平至0.01 mg/kg时，回收率均值为70.6%，相对标准偏差6.2%，满足实验要求，再降低添加浓度得到回收率均值，相对标准偏差不符合实验要求，确定0.01 mg/kg为定量限。《出口食品中六种合成甜味剂的检测方法》（SN/T 3538—2013）中采用液相色谱-质谱/质谱法进行检测，甜蜜素、安赛蜜、糖精钠和阿斯巴甜的测定低限均为1.0 mg/kg[7]；《食品中环己基氨基磺酸钠的测定》（GB 5009.97—2016）中的液相色谱—质谱/质谱法甜蜜素的检出限最低为0.03 mg/kg，本方法的检出限均低于行业标准、国标方法检出限，说明本检测方法灵敏度较高[8]。

2.3 回收率和精密度

用不含有4种甜味剂的黄瓜做基质进行加标试验，分别添加0.05 mg/kg、0.20 mg/kg、0.40 mg/kg的混合标准溶液，每浓度6份平行样本，按照1.3步骤处理并检测，检测结果见表4，各组成分回收率在加标回收率在82.1%～98.2%，相对标准偏差为1.8%～5.8%。满足检测要求。

表4 4种甜味剂的回收率及相对标准偏差

3 结论与讨论

黄瓜是常见的生食蔬菜，本身甜度较低，为了防止商家为增强黄瓜的甜度采用浸泡等方式违法添加一些人工合成的甜味剂，本文建立了黄瓜中人工合成甜味剂的检测方法。人工合成甜味剂种类繁多，考虑阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠和甜蜜素甜度高、用量少、使用率较高，本方法选择这4种甜味剂进行检测。

本方法以超纯水作为萃取试剂，通过高效液相色谱-串联质谱仪，采用电喷雾负离子化模式（ESI-）和多反应检测，外标法定量，同时测定黄瓜中阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠和甜蜜素4种甜味剂。结果表明，该方法可准确测定黄瓜中阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠和甜蜜素4种甜味剂，其相关系数均大于0.99，定量限均为0.01 mg/kg，加标回收率在82.1%～98.2%，从而确认本方法可准确、快捷测定黄瓜中阿斯巴甜、安赛蜜、糖精钠和甜蜜素4种甜味剂。