分散液液微萃取-高效液相色谱法同时测定烟用接装纸中Cr3＋和Cr6＋的含量

王 洋,韩维岐,郭莉莉,金 哲

(吉林烟草工业有限责任公司 技术研发中心,长春 130031)

烟用接装纸加工生产过程中会用到很多原料、染料、助剂等,导致接装纸中含有痕量的铬[1-4]。接装纸直接与口腔接触,其中的痕量铬在卷烟抽吸过程中可能会迁移至体内,对人体造成伤害。铬元素在自然界中主要以Cr3＋和Cr6＋的形式存在。研究表明,Cr3＋是人体必须的微量元素,在维持生物体葡萄糖平衡、蛋白质与脂肪代谢方面有重要作用[5],而Cr6＋具有高毒性,吸入会引起肾炎、贫血、神经炎等疾病,具有强致癌性[6-8]。因此,准确测定烟用接装纸中不同形态铬的含量对卷烟危害性评价有重要意义。

对于铬总量的测定,人们已经做了大量研究[9],但是铬总量不能准确反映它对人体的危害性,要想进一步了解其危害,必须先对其进行分离再分别测定。已报道的分离前处理方法主要有离子交换色谱法[10-11]、浊点萃取法[12-15]、固相萃取法[16]、共沉淀法[17]、液膜萃取法[18]等。由于接装纸样品中Cr3＋和Cr6＋含量较低,为达到更好的检测效果,需要进行富集。液液微萃取是一种常见的富集方法,采用小体积的有机溶剂作为萃取剂,可以大大提高富集倍数,并且高效液相色谱(HPLC)同时具有分离和检测的功能。因此,本工作以二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)为螯合剂,正十二醇为萃取剂,采用液液微萃取富集样品中的Cr3＋和Cr6＋,用HPLC 分离并测定,旨在为烟用接装纸中铬形态的准确测定提供一种新的解决方案。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290型高效液相色谱仪;HY-8A 型数显调速多用振荡器;DU-14 型超声仪;HB-03 型加热锅;TGL-16M 型台式高速冷冻离心机;DMT-2500型多管涡旋混合仪;Milli-Q10型纯水仪;ORION STAR A214型pH 计。

Cr3＋、Cr6＋单标准溶液:1 000 mg·L－1,使用时,用水稀释至所需质量浓度。

DDTC溶液:200 mmol·L－1,称取4.5 g二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物,用水溶解并定容至100 mL。

乙酸、甲醇、正十二醇均为色谱纯;乙酸钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物均为分析纯;试验用水为超纯水(电阻率为18.2 MΩ·cm)。

试验所用样品为烟用接装纸,编号A、B、C、D、E、F。

1.2 仪器工作条件

ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);柱温30 ℃;流动相A 为水,B 为甲醇;流量1 mL·min－1;进样量20μL;二极管阵列检测器(DAD),检测波长258 nm。梯度洗脱程序:0～3.3 min时,A 为25%;3.3～3.6 min时,A 由25%降至10%,保 持2.4 min;6.0～6.5 min 时,A 由10%升至25%,保持1.5 min。

1.3 试验方法

将接装纸样品剪成0.5 cm×0.5 cm 的碎片,混匀,取2 g(精确至0.000 1 g)于50 mL三角瓶中,加入20 mL水,超声提取30 min。分取8 mL 提取液于10 mL离心管中,加入200 mmol·L－1DDTC溶液100μL,用0.2 mol·L－1乙酸钠溶液和0.2 mol·L－1乙酸溶液调节体系酸度至pH 6.0,摇匀,于45 ℃水浴加热10 min,再加入正十二醇60μL(提前30℃水浴溶解)和甲醇100μL,涡旋振荡4 min,于20 ℃以5 000 r·s－1速率离心5 min,取上层正十二醇有机相(固体),最后用甲醇定容至0.5 mL,经0.45μm 有机滤膜过滤至色谱瓶中待测。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

分别取8 mL 200μg·L－1的Cr3＋、Cr6＋单标准溶液于10 mL离心管中,按照1.3节试验方法处理,用DAD 在波长210～640 nm 内进行扫描,得到Cr3＋、Cr6＋螯合物的吸收曲线,如图1所示。

图1 Cr3＋、Cr6＋螯合物的吸收曲线Fig.1 Absorption curves of Cr3＋and Cr6＋chelates

由图1可知,Cr3＋、Cr6＋均在258 nm 处出现最大吸收,故试验选择258 nm 为检测波长。

2.2 流动相的选择

试验考察了流动相体系分别为甲醇-水和乙腈-水时对Cr3＋、Cr6＋螯合物的分离效果。结果表明:以甲醇-水为流动相体系时,目标物的响应值更高,峰形更好,分析时间更短,因此试验选择的流动相体系为甲醇-水。优化后的梯度洗脱程序见1.2 节。100μg·L－1的Cr3＋、Cr6＋混合标准溶液的色谱图见图2。

图2 色谱图Fig.2 Chromatogram

2.3 螯合反应条件的选择

2.3.1 体系酸度

在反应过程中,体系酸度对金属螯合物的形成有着重要作用。改变体系酸度,其他条件按照1.3节试验方法分别对8 mL 200μg·L－1的Cr3＋、Cr6＋单标准溶液进行处理,考察了体系酸度分别为pH 2.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0时 对Cr3＋、Cr6＋螯 合物峰面积的影响。

结果表明:随着pH 的增大,Cr3＋、Cr6＋螯合物的峰面积均呈先增大后减小的趋势;当体系酸度为pH 6.0 时,两种离子螯合物的峰面积均较大。因此,试验选择的体系酸度为pH 6.0。

2.3.2 DDTC溶液浓度

Cr3＋、Cr6＋可以与DDTC发生螯合反应生成不同的螯合物,从而进行分离,因此DDTC 溶液的浓度会对测定结果产生重要影响。试验考察了DDTC溶液浓度分别为50,100,200,300,400 mmol·L－1时对Cr3＋、Cr6＋螯合物峰面积的影响。

结果表明,两种离子螯合物的峰面积随DDTC溶液浓度的增加先增大后趋于稳定,当DDTC 溶液浓度为200 mmol·L－1时,两者峰面积均较大。因此,试验选择的DDTC 溶液浓度为200 mmol·L－1。

2.3.3 反应时间

试验考察了反应时间分别为5,10,15,20,30,40 min时对Cr3＋、Cr6＋螯合物峰面积的影响。

结果表明,随着反应时间的延长,Cr3＋、Cr6＋螯合物峰面积呈先增大后减小的趋势,当反应时间为10 min时达到较大值。因此,试验选择的反应时间为10 min。

2.3.4 反应温度

试验进一步考察了反应温度分别为20,30,40,45,50,60 ℃时对Cr3＋、Cr6＋螯合物峰面积的影响。

结果表明,两种离子螯合物的峰面积随反应温度升高均呈先增大后减小的趋势,当反应温度为45 ℃时,两者峰面积均较大。因此,试验选择的反应温度为45 ℃。

2.4 萃取条件的选择

2.4.1 萃取剂

分别以正十二醇、十六醇和正辛醇为萃取剂进行试验。由于十六醇熔点太高,正辛醇凝固点太低,都不便于试验操作;正十二醇熔点适宜,毒性小,不溶于水,易溶于甲醇,可作为室温下液液微萃取的理想萃取剂。接着,试验考察了萃取剂正十二醇用量分别为10,20,30,40,50,60,70,80,90,100μL时对Cr3＋、Cr6＋螯合物峰面积的影响。

结果表明:Cr3＋、Cr6＋螯合物的峰面积随正十二醇用量的增加呈先增大后减小的趋势;当正十二醇用量为60μL时,两者峰面积均较大。因此,试验选择的萃取剂正十二醇用量为60μL。

2.4.2 分散剂

在液液微萃取过程中,萃取剂越分散、液滴越小,与溶液接触越充分,萃取效率越高。试验考察了无分散剂和分散剂分别为丙酮、甲醇、乙醇、乙腈时对Cr3＋、Cr6＋螯合物峰面积的影响。

结果表明,加入分散剂对Cr3＋、Cr6＋螯合物峰面积有积极影响,其中以丙酮或甲醇为分散剂时,两者峰面积均较大,考虑到方便操作等因素,试验选择的分散剂为甲醇。试验进一步对分散剂用量进行了优化,在其他条件一致的情况下,分别加入50,100,200,300,400,500μL甲醇。结果表明,甲醇用量对结果影响并不大,考虑到操作方便,试验选择的分散剂甲醇用量为100μL。

2.4.3 萃取时间

试验考察了萃取时间分别为1,2,3,4,5 min时对Cr3＋、Cr6＋螯合物峰面积的影响。结果表明,当萃取时间为4 min时,目标物的峰面积较大,因此试验选择的萃取时间为4 min。

2.5 样品提取条件的选择

2.5.1 提取方式

将烟用接装纸样品A 剪成0.5 cm×0.5 cm 的碎片,混匀,取3 份样品于50 mL 三角瓶中,每份2 g(精确至0.000 1 g),加入20 mL 水,分别以浸泡、振荡(转速180～200 r·min－1)、超声3种方式提取3 min;分别取8 mL 提取液,按照1.3节试验方法进行处理和测定,结果见图3。

图3 不同提取方式下Cr3＋、Cr6＋的测定值Fig.3 Determined values of Cr3＋and Cr6＋with different extraction methods

由图3可以看出,采用超声提取时,Cr3＋、Cr6＋的测定值均较高。

2.5.2 提取时间

将烟用接装纸样品A 剪成0.5 cm×0.5 cm 的碎片,混匀,取6 份样品于50 mL 三角瓶中,每份2 g(精确至0.000 1 g),加入20 mL 水,分别超声15,30,45,60,90,120 min;各取8 mL 提取液,按照1.3节试验方法进行处理和测定,结果见图4。

图4 不同提取时间下Cr3＋、Cr6＋的测定值Fig.4 Determined values of Cr3＋and Cr6＋with different extraction time

由图4可以看出:随着提取时间的延长,Cr3＋、Cr6＋的测定值先增大后逐渐保持稳定;当提取30 min时,Cr3＋、Cr6＋的测定值均较大。

综上分析,试验选择的样品提取方式为超声,提取时间为30 min。

2.6 标准曲线与检出限

移取适量的Cr3＋、Cr6＋单标准溶液,用水逐级稀释,配制成Cr3＋、Cr6＋质量浓度为2.00,5.00,10.00,20.00,50.00,100.00μg·L－1的混合标准溶液系列。按照上述优化后的条件进行测定,以Cr3＋、Cr6＋质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,Cr3＋、Cr6＋标准曲线的线性范围均为2.00～100.00μg·L－1,线性回归方程分别为y＝7.532x＋10.95,y＝2.760x－2.689,相关系数分别为0.999 8,0.999 7。

将Cr3＋、Cr6＋单标准溶液逐级稀释,以3倍信噪比(S/N)对应的质量浓度为检出限(3S/N),根据称样量和样品溶液体积换算,所得Cr3＋、Cr6＋的检出限分别为3,6μg·kg－1。

2.7 精密度、回收试验和富集因子

按照试验方法对烟用接装纸样品A 进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定7次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表1。

表1 精密度与回收试验结果(n＝7)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝7)

由表1可知:Cr3＋的回收率为90.7%～105%,测定值的RSD 为4.2%～7.3%;Cr6＋的回收率为84.1%～106%,测定值的RSD 为4.5%～7.6%,满足痕量分析要求。

取20μg·L－1混合标准溶液2份,一份加入正十二醇,一份不加,其余条件皆一致,按照上述优化后的试验条件进行处理、检测,用加入正十二醇的测定值与未加入的测定值相比,计算得到Cr3＋、Cr6＋的富集因子分别为25.6和9.5,可见经正十二醇萃取有效地提高了两者检出的灵敏度。

2.8 样品分析

按照试验方法分别对5种不同烟用接装纸样品进行测定,结果见表2。

表2 样品分析结果Tab.2 Analytical results of the samples

由表2可知,接装纸样品中Cr6＋含量比Cr3＋含量高,部分接装纸样品中未检出Cr3＋。

本工作提出了分散液液微萃取-HPLC 同时测定烟用接装纸中Cr3＋和Cr6＋含量的方法。用水超声提取接装纸样品30 min,以DDTC 为螯合剂,正十二醇为萃取剂,甲醇为分散剂,同时富集样品中的Cr3＋和Cr6＋,用HPLC分离并测定。该方法灵敏度高、检出限低、稳定性好,并且具有良好的精密度、回收率和较高的富集倍数,适用于烟用接装纸中Cr3＋和Cr6＋的同时测定。