超高效液相色谱法-电化学检测器同时测定大血藤中8种化学成分的含量

淳泽利,肖 欣,张 勇,王方远,陈荣祥

(1.遵义医科大学 生命科学研究院,遵义 563000;2.遵义医科大学 遵义市理化分析测试工程技术研究中心,遵义 563000)

大血藤又称红藤、红皮藤、大活血等,系木通科藤本植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.et Wils.的干燥藤茎,具有清热解毒、活血、祛风等功效,常用于肠痈腹痛、经闭痛经、风湿痹痛、跌扑肿痛等[1]。现代药理研究表明大血藤及其提取物具有抗炎、镇痛、抑菌等药理作用[2-3]。大血藤的化学成分主要有酚酸类、苯乙醇类、苯丙酸类、木脂素类、黄酮类、三萜类等化合物[2,4-5],其中酚酸类(原儿茶酸等)、苯乙醇类(红景天苷、羟基酪醇、酪醇等)和苯丙酸类(绿原酸、隐绿原酸等)化合物在数量和质量上都占有较大比例[4]。

对于大血藤中化学成分含量的测定,文献报道大多是针对绿原酸、红景天苷、原儿茶酸、表儿茶素等,未见儿茶素、羟基酪醇、酪醇、隐绿原酸含量测定的报道[6-9];在仪器检测方面,文献中多采用高效液相色谱法、超高效液相色谱法,配紫外检测器或二极管阵列检测器(DAD)等光学检测器,未见电化学检测器(ECD)测定大血藤中化学成分含量的报道[6-10]。相较于传统的光学检测器,ECD 灵敏度高,可达fmol水平[11-12];并且选择性强,只对易于氧化还原的化合物有响应;同时,ECD 的谱图更为简洁[13]。库仑检测池和安培检测池为ECD 中常用的两种检测池,其中安培检测池工作电极的材料多样,金、银、铂、玻碳等均为常见的工作电极,通过调节工作电极与对电极的间隙可提高检测的灵敏度,但其表面积较小,长时间使用易造成电极污染,需要对电极进行定期维护;库仑检测池工作电极的材料较为单一,通常为多孔石墨电极,其表面积远大于安培检测池的工作电极,抗污染能力强,同时待测化合物在多孔石墨电极上可接近完全氧化,响应值也较高[14-15]。目前,ECD 已用于酚酸、抗生素、氨基酸等物质的检测,并广泛应用于医药、环境、化学等领域[12-17]。

羟基酪醇、原儿茶酸、红景天苷、酪醇、儿茶素、隐绿原酸、绿原酸及表儿茶素均含有酚羟基,极易被氧化,可直接采用ECD 在直流模式下进行检测。鉴于此,本工作提出了超高效液相色谱法-ECD 测定大血藤药材中绿原酸、红景天苷、羟基酪醇等8种化学成分的含量,为大血藤药材的质量控制提供科学依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

U3000型超高效液相色谱仪,配Chromeleon 7.1工作站、ECD-3000 RS(检测池为6011库仑检测池,工作电极为多孔石墨电极,参比电极为钯电极)及DAD-3400 RS等检测器;Legend Micro 17小型台式离心机;SB-5200DT 型超声波清洗机;ME104E型电子分析天平;FE 28型pH 计;Purelab Chorus超纯水系统。

柠檬酸盐缓冲液(pH 2.76):50 mmol·L－1,分别称取柠檬酸4.6 g、一水合柠檬酸钾0.8 g,加入500 mL水,溶解并混匀,抽滤。

单标准储备溶液:称取适量的羟基酪醇、原儿茶酸、红景天苷、酪醇、儿茶素、隐绿原酸、绿原酸和表儿茶素标准品,用甲醇溶解,配制成质量浓度为2 g·L－1的单标准储备溶液,于4 ℃冰箱冷藏,备用。

混合标准溶液:移取适量的单标准储备溶液,用50%(体积分数,下同)甲醇溶液稀释,配制成羟基酪醇、原儿茶酸、儿茶素、隐绿原酸质量浓度为20 mg·L－1,红景天苷质量浓度为100 mg·L－1,酪醇质量浓度为5 mg·L－1,绿原酸质量浓度为400 mg·L－1,表儿茶素质量浓度为200 mg·L－1的混合标准溶液。使用时,用50%甲醇溶液稀释至所需质量浓度。

酪醇标准品的纯度不小于98%,批号H1 817069;红景天苷标准品的纯度不小于98%,批号G1 817039;羟基酪醇标准品的纯度不小于98.30%,批号AK-45213;绿原酸标准品的纯度不小于98%,批号J1 523050;原儿茶酸标准品的纯度不小于97%,批号K1 717091;表儿茶素标准品的纯度不小于97%,批号L1 824045;隐绿原酸标准品的纯度为99.28%,批号71 900010;儿茶素标准品的纯度大于97%,批号ZNJZK-HM。

甲醇、乙腈为色谱纯;一水合柠檬酸钾、柠檬酸为分析纯;试验用水为超纯水。

24批大血藤样品采自贵州、广西、安徽、云南、湖北、陕西、四川、广东等地,参考《中华人民共和国药典》2020年版(简称Ch P 2020),经笔者鉴定为木通科藤本植物大血藤的干燥藤茎。

1.2 仪器工作条件

Waters ACQUITY UPLC®BEH Shield RP18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温45 ℃;流动相A 为乙腈,B 为50 mmol·L－1柠檬酸盐缓冲液(pH 2.76);流量0.4 mL·min－1;进样量1μL;自动进样器温度10 ℃。梯度洗脱程序:0～3 min时,A 为5%;3～6 min 时,A 由5%升 至10%,保持3 min。ECD 库仑检测池的检测电压,第一通道为350 mV(用于检测羟基酪醇、原儿茶酸、隐绿原酸、绿原酸、儿茶素和表儿茶素),第二通道为600 mV(用于检测红景天苷、酪醇)。

1.3 试验方法

称取大血藤样品粉末约1 g,过0.42 mm(60目)孔筛并记录称样量;将其置于50 mL具塞试管中,加入30%(体积分数,下同)甲醇溶液30 mL,称重;超声提取10 min,冷却,再称重,加入30%甲醇溶液补足减失重量;将提取液以10 000 r·min－1转速离心10 min,上清液经0.22μm 滤膜过滤后进样分析。

2 结果与讨论

2.1 检测器的选择

试验尝试选用DAD 对混合标准溶液进行扫描。结果显示:羟基酪醇、红景天苷、酪醇、儿茶素、表儿茶素在276～280 nm 内有特异性紫外吸收;原儿茶酸的最大吸收波长为260 nm;隐绿原酸、绿原酸的最大吸收波长为330 nm。因此,当色谱柱、柱温、流动相、进样量等条件一致时,设置DAD 的检测波长分别为260,280,330 nm。

分别选用ECD 和DAD 对低浓度混合标准溶液(其中羟基酪醇、原儿茶酸、儿茶素、隐绿原酸质量浓度为0.25 mg·L－1,红景天苷质量浓度为1.25 mg·L－1,酪醇质量浓度为0.062 5 mg·L－1,绿原酸质量浓度为5 mg·L－1,表儿茶素质量浓度为2.5 mg·L－1)进行分析,所得色谱图见图1。以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),比较两种检测器的灵敏度,结果见表1。

图1 ECD与DAD下的色谱图Fig.1 Chromatograms with ECD and DAD

表1 ECD与DAD下8种化学成分的检出限Tab.1 Detection limits of 8 chemical components with ECD and DAD

结果显示:选用ECD 进行检测时,8种化学成分均被检出,如图1(a)所示;选用DAD 进行检测时,仅原儿茶酸、红景天苷、隐绿原酸、绿原酸、表儿茶素被检出,如图1(b)所示;并且由表1可知,ECD的检出限远低于DAD 的,表明ECD 具有较高的灵敏度。因此,试验选择的检测器为ECD。

2.2 检测电压的选择

对混合标准溶液进行测定,考察了检测电压分别为0,50,100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700 mV 时对8种化学成分峰面积的影响,结果见图2。

图2 检测电压对化学成分峰面积的影响Fig.2 Effect of detection voltage on the peak area of chemical component

结果表明:当检测电压大于300mV时,羟基酪醇、原儿茶酸、隐绿原酸、绿原酸峰面积较大并且保持平稳,说明此时已被完全氧化,故选用350mV 为羟基酪醇、原儿茶酸、隐绿原酸、绿原酸的检测电压;当检测电压小于400mV时,红景天苷和酪醇峰面积较小,几乎没有被氧化,当检测电压升高至600mV时,二者的峰面积较大,被完全氧化,故选用600mV为红景天苷和酪醇的检测电压;当检测电压为250mV时,儿茶素和表儿茶素氧化达到第一个平台,250～400mV时,二者峰面积稳定,超过400mV时,儿茶素和表儿茶素的峰面积随检测电压的升高而增大,故选用350mV为儿茶素和表儿茶素的检测电压。

2.3 提取条件的选择

2.3.1 提取方式

试验考察了回流提取、超声提取对大血藤样品中8种化学成分峰面积的影响。结果表明,经两种方式提取后,8种化学成分的峰面积无明显差异,但超声提取相对省时、方便,操作误差较小,因此试验选择的提取方式为超声提取。

2.3.2 甲醇溶液体积分数

固定提取时间为10 min,提取1次,考察了甲醇溶液体积分数分别为15%,30%,45%,60%,75%,90%时对大血藤样品中8种化学成分总峰面积的影响,结果见图3。

图3 甲醇溶液的体积分数对8种化学成分总峰面积的影响Fig.3 Effect of volume fraction of methanol solution on the total peak area of 8 chemical components

由图3可知,当甲醇溶液体积分数为30%时,大血藤样品中8种化学成分总峰面积较高,因此试验选择的甲醇溶液体积分数为30%。

2.3.3 提取时间

以30%甲醇溶液为提取溶剂,提取1次,考察了超声提取时间分别为5,10,15,20,30,45 min时对大血藤样品中8种化学成分总峰面积的影响,结果见图4。

由图4可知,当超声提取10 min时,8种化学成分的总峰面积较高,因此试验选择的提取时间为10 min。

图4 提取时间对8种化学成分总峰面积的影响Fig.4 Effect of extraction time on the total peak area of 8 chemical components

2.3.4 提取次数

以30% 甲醇溶液为提取溶剂,超声提取10 min,分别提取大血藤样品1,2次,考察了提取次数对8种化学成分峰面积的影响,提取1次的大血藤样品进样前采用30%甲醇溶液按1∶1体积比稀释。结果表明,提取次数对大血藤样品中8种化学成分峰面积无明显影响,考虑到试验操作方便,选择的提取次数为1次。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

移取适量的混合标准溶液,用50%甲醇溶液逐级稀释,配制成羟基酪醇、原儿茶酸、儿茶素、隐绿原酸质量浓度为0.5,1,2,5,10,20 mg·L－1,红景天苷质量浓度为2.5,5.0,10,25,50,100 mg·L－1,酪醇质量浓度为0.125,0.250,0.500,1.25,2.50,5.00 mg·L－1,绿原酸质量浓度为10,20,40,100,200,400 mg·L－1,表儿茶素质量浓度为5,10,20,50,100,200 mg·L－1的混合标准溶液系列。按照仪器工作条件进行测定,以各目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表2。

8种化学成分的检出限结果见2.1 节中表1。以10倍信噪比计算测定下限(10S/N),结果见表2。

表2 线性参数和测定下限Tab.2 Linearity parameters and lower limits of determination

2.5 精密度试验

2.5.1 仪器精密度

按照仪器工作条件,对羟基酪醇、原儿茶酸、儿茶素、隐绿原酸质量浓度为0.5 mg·L－1,红景天苷质量浓度为2.5 mg·L－1,酪醇质量浓度为0.125 mg·L－1,绿原酸质量浓度为10 mg·L－1,表儿茶素质量浓度为5 mg·L－1的混合标准溶液连续进样6 次,记录峰面积并计算相对标准偏差(RSD)。结果显示,羟基酪醇、原儿茶酸、红景天苷、酪醇、儿茶素、隐绿原酸、绿原酸和表儿茶素峰面积的RSD依次为0.40%,0.29%,2.0%,1.5%,0.43%,0.35%,0.39%和0.38%,表明仪器的精密度良好。

2.5.2 重复性

按照试验方法对6份S1样品进行分析,计算各目标物峰面积的RSD。结果显示,羟基酪醇、原儿茶酸、红景天苷、酪醇、儿茶素、隐绿原酸、绿原酸和表儿茶素峰面积的RSD依次为3.3%,2.2%,2.7%,2.9%,2.5%,1.6%,1.7%和1.6%,表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

按照仪器工作条件,分别在S1 样品溶液放置0,2,4,6,8,10,12 h 时进样分析,计算各目标物峰面积的RSD。结果显示,羟基酪醇、原儿茶酸、红景天苷、酪醇、儿茶素、隐绿原酸、绿原酸和表儿茶素峰面积的RSD依次为1.5%,1.8%,4.2%,3.4%,1.7%,1.4%,0.91%和1.3%,表明该方法稳定性良好。

2.7 回收试验

按照试验方法对6份S1样品(0.501 7±0.002 1)g进行加标回收试验,计算回收率,结果见表3。

表3 回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

2.8 样品分析

按照试验方法对24批不同产地的大血藤药材进行分析,结果见表4。其中S1样品溶液的色谱图见图5。

图5 S1样品溶液的色谱图Fig.5 Chromatograms of S1 sample solution

由表4可知,24批不同产地大血藤样品中绿原酸含量较高,其次是表儿茶素和红景天苷,羟基酪醇、原儿茶酸、酪醇、儿茶素和隐绿原酸的含量均低于1 mg·g－1。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of the samples

表4 (续)

ChP2020中规定大血藤中红景天苷的质量分数不得少于0.040%,绿原酸的质量分数不得少于0.20%。24批样品中,S4,S15,S16,S18中红景天苷的质量分数依次为0.033%,0.037%,0.035%,0.017%,小于0.040%,不符合ChP2020的规定;S2,S3,S15,S18 中,绿原酸的质量分数依次为0.16%,0.17%,0.18%,0.08%,小于0.20%,不符合ChP 2020的规定。由此可见,S15和S18样品为伪劣药材。

本工作通过优化检测条件、提取条件,提出了超高效液相色谱法-ECD 测定大血藤中8种化学成分含量的方法。该方法操作简便、准确、灵敏,能够较全面、客观地反映不同产地大血藤样品中8种化学成分的含量差异,对于评价大血藤质量优劣有一定的参考价值。