涂布镍钛合金表面的人血管内皮细胞生长因子重组质粒转染初步研究

段 林， 何艳艳， 李天晓， 陈 松， 贺迎坤， 吴海刚， 卢韬源

目前脑血管介入技术已取得重大进展，但颅内支架应用过程中仍存在早期脑卒中风险和支架内再狭窄问题［1-2］。这可能与支架植入时血管内皮受损导致内膜下成分暴露， 炎性细胞如中性粒细胞浸润，平滑肌细胞和成纤维细胞增殖、迁移，血管外基质重构以及炎性反应有关［3-4］。支架植入后可发生再内皮化，防止支架与血流接触，促进活性因子的释放，从而抑制血栓形成和炎症，降低支架内再狭窄［5］。 许多学者将其视为改善支架性能的潜在突破点。Wu 等［6］将不同程度上调和下调的血管内皮细胞生长因子（VEGF）转染的内皮细胞支架分别置入兔腹主动脉，1 周后发现VEGF 过表达的内皮细胞支架被完全覆盖，而VEGF 干扰组兔则延迟至4 周，表明过VEGF表达可减少新内膜增生，促进内皮化，降低支架内再狭窄。 不过该实验存在细胞支架储存、运输和植入操作不便问题。本实验利用细胞胞吞作用，将基质胶、黏连蛋白和人VEGF 重组质粒作为镍钛合金丝涂层液，以便质粒主动运输至细胞内并进行表达。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

人VEGF 重组质粒由本中心实验室原先合成。人脐静脉内皮细胞购自中国科学院， 镍钛合金丝（d=0.66 mm）由湖南瑞康通科技发展公司提供。 基质胶、 黏连蛋白购自北京索莱宝科技公司，Hoechst荧光染料和4%多聚甲醛购自上海碧云天生物技术公司， 人脐静脉内皮细胞培养液购自武汉普诺赛生命科技公司，胰酶和磷酸缓冲液（PBS）购自美国Thermo Fisher 科技公司。

1.2 镍钛合金丝表面处理和涂层制备

将镍钛合金丝剪成1 cm 长，分别用丙酮、无水乙醇和去离子水超声10 min，洗去表面污渍，氮气吹干后置于4℃冰箱备用。 将分装的基质胶、黏连蛋白和人VEGF 重组质粒于4℃冰箱过夜解冻， 在低温配液恒温模块上用预冷枪头将涂层液配制成基质胶（5 mg/mL）、黏连蛋白（40 μg/mL）、重组质粒（50 ng/μL）混合液，置于4℃脱色摇床过夜摇匀。 生物安全柜中，镍钛合金丝用PBS 清洗3 遍，浸泡于放置低温配液恒温模块上的涂层液30 min；取出镍钛合金丝，放入24 孔细胞培养板，一并置于37℃细胞培养箱1 h；取出镍钛合金丝，用PBS 轻轻清洗2 遍，转移至新的24 孔板，等待细胞接种。

1.3 细胞培养和接种

生物安全柜紫外灭菌30 min； 取冻存细胞于37℃水浴中快速溶解，离心（1 000 r/min）3 min；弃上清液，加入2 mL 完全培养基重悬；细胞悬液转入含8 mL 完全培养基的10 cm 培养皿，摇匀，镜下观察细胞状态，置于细胞培养箱，次日换液，待细胞密度达90%左右行传代和接种；吸弃旧培养基，PBS 清洗2 遍，加入1 mL 胰酶，镜下观察细胞形态，待细胞变圆加入2 mL 完全培养基终止消化， 移入15 mL离心管，1 000 r/min 离心3 min，弃上清液，加入2 mL完全培养基重悬，从中吸取10 μL 悬液于血球计数板计数， 以每孔8×104细胞量接种于上述镍钛合金丝，并培养48 h。 其余悬液按比铺板于10 cm 培养皿，继续培养备用。

1.4 细胞染色和检测

48 h 后取出24 孔板， 生物安全柜中吸弃旧培养基，用PBS 清洗2 遍，将全部镍钛合金丝转至新的24 孔板中， 滴加多聚甲醛固定液使其淹盖镍钛合金丝表面， 固定15 min， 取出分装的Hoechst 染料，避光1∶1 000 稀释，并滴加24 孔板中，淹盖镍钛合金丝表面，15 min 后用锡纸将其包裹， 进行正置荧光检测。

2 结果

48 h 后， 正置荧光显微镜观测到基质胶+黏连蛋白包被的镍钛合金丝表面细胞有蓝色荧光，无绿色荧光；含人VEGF 重组质粒包被的镍钛合金丝表面细胞有蓝色荧光和绿色荧光，如图1 所示。 表明人VEGF 重组质粒已转染至人脐静脉内皮细胞并进行表达，与预期结果一致，为下一步构建此类重组质粒涂层尊定了基础。

图1 正置荧光显微镜下质粒转染示意图

3 讨论

随着介入器材改进，以及水凝胶、聚羟基乙酸（PGA）、乙交酯-丙交酯共聚物（PGLA）、纤维和聚四氟乙烯等修饰的弹簧圈，药物洗脱支架和覆膜支架临床应用，神经介入术治疗脑血管疾病效果不断提高［7-8］。 但目前经修饰的材料基本是不可降解材料，植入后仍会发生炎症、术后再内皮化延迟、血栓形成和支架内再狭窄等［9-11］，其基因分子层面研究与实施仍处于探索阶段。

基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷与异常基因引起的疾病，达到治疗目的。 其中也包括转基因等方面技术应用，也就是将外源基因通过基因转移技术插入患者适当的受体细胞，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。 基因治疗广义上还可包括从DNA 水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。DNA 这种仅被称为遗传信息的物质，因其序列可编程性、分子识别性、可重构性和可预测的自组装性，以惊人的速度被鉴定并作为一种新材料被利用［12-13］。 DNA 本身是一种天然纳米尺度材料［14］，其衍生物如DNA-RNA［15］、DNA-金属杂交体［16］和肽核酸（PNA）［17］可通过编程技术转换成具有明确取向、间距、立体关系及与生物分子更优相互作用的自组装材料，这使其在改进材料发展和临床应用中具有里程碑意义［18-19］。 质粒是基因工程最常见运载体和细胞染色体外能自主复制的一种很小的环状DNA 分子， 它的存在与否一般对宿主细胞生存无决定性作用，是基因治疗中的理想媒介。 Zha 等［20］用电转法构建一种含VEGF 重组质粒的外泌体，并将其与3D 打印的多孔骨支架结合，体内研究表明该支架可有效诱导大量血管化骨再生。同样Ding 等［21］将编码基质金属蛋白酶-3 组织抑制因子的质粒冻干在金属-聚合物导体支架内表面，动物实验表明该支架可明显抑制兔模型静脉移植的内皮增生。

本实验利用细胞胞吞作用，将基质胶、黏连蛋白和人VEGF 重组质粒作为镍钛合金丝涂层液进行表面修饰，以便质粒主动运输至细胞内并进行表达，正置荧光显微镜观测到人VEGF 重组质粒组镍钛合金丝表面细胞含绿色荧光，表明人VEGF 重组质粒转染成功， 也为构建质粒基因涂层尊定了基础。 本实验创新之处：基质胶在10℃以上会发生凝固成胶，此特性符合人体温度；基质胶本身有促进细胞生长的作用，对人体无细胞毒性；质粒通过主动转运进入细胞， 动物实验时不需其他辅助手段。但也存在不足之处，仅靠质粒主动转运作用效率较低，涂层粘附性欠缺，对于是否达到治疗的理想状态，还需进一步验证涂层的生物学特性以及后期动物实验模型验证。