氧化应激促进重组腺相关病毒2型体外转导分析

王晓， 黄晓平， 黎玲， 刘嘉， 刁勇

(1. 华侨大学 医学院， 福建 泉州 362021； 2. 泉州师范学院 化工与材料学院， 福建 泉州 362000)

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是一种无包膜、单链的DNA病毒，需要腺病毒或单纯疱疹病毒辅助才可进行复制，AAV基因组可以在细胞和组织中长期存在，迄今未发现AAV与任何人类疾病相关[1-2].而重组AAV(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体，因具有免疫原性小、宿主范围广、理化性质稳定、能长期表达外源基因等优点，被公认为是基因治疗的理想载体[3-4].2017年12月，以rAAV为载体治疗遗传性视网膜病变的基因药物Luxturna在美国上市，这无疑给以rAAV为载体的基因治疗带来了前所未有的光明[5-7].

但在临床实验中，rAAV也遇到表达效率低的问题，提高rAAV的表达效率成为基因治疗领域需解决的一个问题[8-9].血清型筛选、衣壳蛋白突变和修饰、基因组改造等生物技术在提高表达效率方面取得了一定进展[10-11].除了生物技术策略外，现已有多种非生物技术策略可提高rAAV载体表达效率，如DNA损伤剂(紫外线、γ-射线、顺铂)、泛素蛋白酶体抑制剂(MG132，LnLL)、DNA合成酶抑制剂(巴菲敌柯林、羟基脲)、DNA拓扑异构酶抑制剂(喜树碱、依托泊苷)等[12-14].这些手段可以影响rAAV载体在细胞质内的传递，或影响其在核内的行为，在表达效率优化方面表现出了良好的应用前景.

氧化应激会造成生物膜不饱和脂肪酸过氧化、DNA损伤等，而DNA损伤剂已证实可促进rAAV转导，但氧化应激促进rAAV转导的机制目前尚未研究清楚.在细胞中，过氧化氢(H2O2)的初始产物通常认为是活性氧(ROS)或超氧阴离子，H2O2也被认为是活性氧中间体(ROI)介导的细胞损伤的关键物质.H2O2产物羟基自由基(HO·)可以氧化DNA、蛋白质和膜脂质，导致细胞损伤.本文以重组腺相关病毒2型(rAAV2)为材料，研究H2O2和铁过载(Fe-NTA)处理前、后，细胞中rAAV2转基因表达量、阳性细胞数和基因组数目的变化，从ROS角度揭示氧化应激促进rAAV2转导的分子机制.

1 材料与方法

1.1 材料

聚乙烯亚胺(PEI，美国Polysciences公司)；蛋白罗丹明标记试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)；超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium，美国Invitrogen公司)；硝酸铁(Fe(NO3)3)、次氮基三乙酸(NTA)、H2O2(美国Amresco公司)；DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；核酸酶Benzonase(德国Merk公司)；DNeasy Blood & Tissue试剂盒(德国QIAGEN公司)；Sybr Green Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司).

1.2 rAAV2载体的制备

参照本实验室的rAAV制备方法[15-16]：待293T细胞密度达到85%时，将三质粒与PEI按照质量比为1∶3进行混合后共转染293T细胞；转染72 h后收获细胞，裂解并用Benzonase处理；氯化铯密度梯度离心分离、透析和浓缩制备符合实验要求的rAAV2载体；最后，进行实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)分析.

1.3 rAAV2载体的标记

参考文献[17]的方法，利用蛋白罗丹明标记试剂盒对rAAV2进行四甲基罗丹明(TAMRA)的荧光标记，并用于共聚焦成像.将物质的量比为1∶5 000的rAAV2载体和mono-NHS-TAMRA分子在室温下孵育45 min，然后通过SpinOUT GT-600型色谱柱去除未结合的染料，再利用qPCR对rAAV2进行定量分析.H2O2刺激Hela细胞12 h后，TAMRA-rAAV2以感染复数(MOI)为1∶2 000转导Hela细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次；采用质量浓度为0.04 g·mL-1的多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤2次，再用双蒸水洗涤；最后，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行复染，利用Zeiss LSM 710型激光共聚焦显微镜分析TAMRA-rAAV2病毒载体的亚细胞定位.

1.4 转导实验

按照每孔1×105个将细胞接种至24孔板，根据设置的时间在转导前进行氧化应激，随后用表达荧光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)或绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转基因的rAAV2进行转导，转导后利用IncuCyte实时动态细胞成像分析系统检测阳性细胞数、荧光强度或取上清测定Gluc的表达量.

1.5 rAAV2基因组提取和qPCR定量

rAAV2转导细胞12 h后，通过胰蛋白酶消化收集细胞，利用DNeasy Blood & Tissue试剂盒收集总DNA，采用qPCR方法分析rAAV2基因组数目，按照文献[18]的方法进行病毒基因组定量.以GFP(正向引物，5′-GAGCGCACCATCTTCTTCAA-3′；反向引物，5′-TCCTTGAAGTCGATGCCCTT-3′)、Gluc(正向引物，5′-AATGCCCGGAAAGCTGGCTG-3′；反向引物，5′-CGATGAACTGCTCCATGGGC-3′)、人β肌动蛋白(正向引物，5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3；反向引物，5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′)为引物，以Sybr Green Master Mix为染料进行qPCR反应，反应条件为95 ℃，2 min，之后按95 ℃，10 s；60 ℃，10 s；72 ℃，10 s循环40次.

1.6 H2O2应激模型

以每孔4.0×103个细胞接种于96 孔板，细胞贴壁后，加入终浓度分别为25，50，100，200，400，800 μmol·L-1的H2O2，按照设定的时间进行rAAV2转导，利用IncuCyte实时动态细胞成像分析系统监测细胞中绿色荧光表达情况，统计分析阳性细胞数和荧光强度.

1.7 Fe-NTA应激模型

参照文献[19]的方法，取20 mL 100 mmol·L-1Fe(NO3)3溶液与20 mL 300 mmol L-1NTA溶液混合，用1 mol·L-1碳酸氢钠溶液调节至pH=7.4，定容至100 mL，配成20 mmol·L-1的Fe-NTA母液.以每孔4.0×103个细胞接种于96孔板，细胞贴壁后，加入终浓度分别为12.5，25.0，50.0，100.0，200.0，400.0 μmol·L-1的Fe-NTA溶液，按照设定的时间和MOI进行rAAV2转导，利用IncuCyte实时动态细胞成像分析系统监测细胞中绿色荧光表达情况，统计分析阳性细胞数和荧光强度.

1.8 细胞内ROS检测

细胞经过氧化应激和转导处理后，去除培养液，用PBS冲洗2 遍；然后，加入10 μmol·L-1超氧化物阴离子荧光探针(Dihydroethidium，DHE)工作液，37 ℃孵育60 min，用PBS清洗2 遍；荧光显微镜观察拍照，利用Image-Pro Plus软件进行荧光强度分析.

1.9 数据统计

所有数据用平均值±标准偏差(x±s)表示，结果采用SPSS统计学分析，*P<0.05表示差异具有统计学意义，**P<0.01表示差异极具统计学意义.

2 实验结果与分析

2.1 H2O2和Fe-NTA对细胞活力的影响

氧化应激对细胞活力的影响，如图1所示.图1中：c为浓度；η为细胞活力.

(a) H2O2 (b) Fe-NTA图1 氧化应激对细胞活力的影响Fig.1 Effect of oxidative stress on cell viability

由图1(a)可知：当加入的H2O2浓度c(H2O2)=400 μmol·L-1时，细胞活力为(86.3±4.3)%，与对照组相比，差异具有统计学意义；当c(H2O2)=800 μmol·L-1时，细胞活力为(65.7±3.9)%，与对照组相比，差异具有统计学意义；而当c(H2O2)=200 μmol·L-1时，细胞活力为(93.6±3.9)%，与对照组相比，差异无统计学意义.

由图1(b)可知：当c(Fe-NTA)=400.0 μmol·L-1时，细胞活力为(84.6±4.6)%，与对照组相比，差异具有统计学意义；而c(Fe-NTA)=200.0 μmol·L-1时，细胞活力为(92.9±5.4)%，与对照组相比，差异无统计学意义.

2.2 H2O2促进rAA2转导

不同细胞中添加H2O2对rAAV2转基因表达的影响，如图2所示.图2中：N1为不同H2O2浓度处理组rAAV2转基因表达量与对照组rAAV2转基因表达量的比值.由图2可知：H2O2能够促进rAAV2转基因在293T细胞中表达，随着H2O2浓度的增高，Gluc的表达量增大，与对照组相比，差异具有统计学意义.50 μmol·L-1组Gluc的表达量是对照组的1.4倍；100 μmol·L-1组Gluc的表达量是对照组的2.5倍；200 μmol·L-1组Gluc的表达量是对照组的3.6倍(图2(a)).在LO-2，Hela，A549细胞中，H2O2均能促进rAAV转基因的表达，与对照组相比，差异具有统计学意义(图2(b)～(d)).

(a) 293T细胞 (b) LO-2细胞

(c) Hela细胞 (d) A549细胞图2 不同细胞中添加H2O2对rAAV2转基因表达的影响Fig.2 Effects of adding H2O2 in different cells on rAAV2 transgene expression

不同H2O2浓度对rAAV2转导的影响，如图3所示.图3中：n为GFP阳性表达细胞数；N2为不同H2O2浓度处理组病毒基因组数与对照组病毒基因组数的比值.图3(a)～(e)为GFP阳性表达细胞及其数量的统计结果.由图3(e)可知：H2O2处理组阳性表达细胞数与对照组相比差异具有统计学意义；当H2O2浓度分别为50，100，200 μmol·L-1时，其阳性表达细胞数分别为(183±16)，(248±22)，(421±25)个·mm-2.rAAV转导细胞12 h后提取基因组的结果，如图3(f)所示.由图3(f)可知：H2O2氧化应激处理组的基因组数明显比对照组多；浓度为50，100，200 μmol·L-1H2O2处理组的基因组数分别是对照组的(1.55±0.21)，(2.33±0.25)，(3.28±0.25)倍.

(a) 对照组 (b) c(H2O2)=50 μmol·L-1

(c) c(H2O2)=100 μmol·L-1 (d) c(H2O2)=200 μmol·L-1

(e) 阳性细胞数 (f) 基因组数图3 不同H2O2浓度对rAAV2转导的影响Fig.3 Effects of different H2O2 concentrations on rAAV2 transduction

2.3 Fe-NTA氧化应激促进rAAV2转导

不同细胞中添加Fe-NTA对rAAV2转基因表达的影响，如图4所示.图4中：N3为不同Fe-NTA浓度处理组rAAV2转基因表达量与对照组rAAV2转基因表达量的比值.

(a) 293T细胞 (b) LO-2细胞

(c) Hela细胞 (d) A549细胞图4 不同细胞添加Fe-NTA对rAAV2转基因表达的影响Fig.4 Effects of adding Fe-NTA in different cells on rAAV2 transgene expression

由图4可知：在293T细胞中，25 μmol·L-1Fe-NTA能促进Gluc表达，其表达量是对照组的1.5倍，50 μmol·L-1Fe-NTA促进Gluc表达量是对照组的2.3倍，100 μmol·L-1Fe-NTA促进Gluc表达量是对照组的3.6倍，与对照组相比，差异具有统计学意义；在LO-2，Hela，A549细胞中，Fe-NTA氧化应激同样能促进rAAV2转基因表达.

不同Fe-NTA浓度对rAAV2转导的影响，如图5所示.图5中：N4为不同Fe-NTA浓度处理组病毒基因组数与对照组病毒基因组数的比值.由图5(a)～(e)可知：在Fe-NTA氧化模型中，25，50，100 μmol·L-1Fe-NTA处理组的GFP阳性细胞数分别为(178±14)，(288±24)，(428±28)个·mm-2，与对照组相比，差异均具有统计学意义.经Fe-NTA处理后，提取细胞中rAAV2基因组进行定量分析，结果如图5(f)所示.由图5(f)可知：25，50，100 μmol·L-1Fe-NTA处理组的病毒基因组数目分别是对照组的(1.45±0.19)，(2.45±0.23)，(3.29±0.31)倍.

(a) 对照组 (b) c(Fe-NTA)=25 μmol·L-1

(c) c(Fe-NTA)=50 μmol·L-1 (d) c(Fe-NTA)=100 μmol·L-1

(e) 阳性细胞数 (f) 基因组数 图5 不同Fe-NTA浓度对rAAV2转导的影响Fig.5 Effects of different Fe-NTA concentrations on rAAV2 transduction

2.4 ROS促使rAAV2在细胞中的积累

有研究表明，rAAV2首先转运至核周区域的微管上，然后一部分rAAV2颗粒进入细胞核，在细胞核内脱壳[18，20-21].利用荧光标记的rAAV2(TAMRA-rAAV2)结合共聚焦显微镜的方法，对rAAV2在氧化应激细胞中的运输及分布进行分析.不同处理组TAMRA-rAAV2的亚细胞定位，如图6所示.

(a) PBS处理3 h (b) PBS处理6 h (c) PBS处理12 h (d) PBS处理24 h

(e) H2O2处理3 h (f) H2O2处理6 h (g) H2O2处理12 h (h) H2O2处理24 h图6 不同处理组TAMRA-rAAV2的亚细胞定位Fig.6 Subcellular localization of TAMRA-rAAV2 in different treatment groups

由图6可知：在转导后3 h，对照组和H2O2处理组的TAMRA-rAAV2在细胞内的定位差异非常小(图6(a)，(e))；然而，转导后6 h，对照组细胞核周围有一些TAMRA-rAAV2载体聚集(图6(b))，但H2O2处理的细胞中TAMRA-rAAV2载体在核周的积累量更多(图6(f))；转导后12 h，对照组TAMRA-rAAV2载体急剧减少(图6(c))，而H2O2处理组TAMRA-rAAV2载体聚集在核孔附近(图6(g))；转导后24 h，这种作用更加明显，对照组的细胞中几乎没有残留TAMRA-rAAV2病毒载体(图6(d))，而H2O2处理的细胞中仍然有TAMRA-rAAV2载体在核周区域聚集(图6(h)).这些数据表明，H2O2可防止转导过程中细胞内rAAV2的损失.

氧化应激过程会产生大量的ROS，ROS被认为是氧化应激对细胞产生损伤的主要物质，而ROS是否是促进rAAV2转导的主要物质还需进一步验证.不同Fe-NTA浓度对ROS产生的影响，如图7所示.图7中：RLU为相对光单位.由图7可知：Fe-NTA处理后的细胞都会在细胞内形成ROS，而且随着Fe-NTA浓度的增大，荧光强度增高，细胞中ROS水平增高.

(a) 对照组 (b) c(Fe-NTA)=25 μmol·L-1 (c) c(Fe-NTA)=50 μmol·L-1

用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)清除细胞内ROS，考察ROS是否介导rAAV2转导，结果如图8所示.由图8可知：H2O2诱导生成的ROS随着NAC浓度的增大而逐渐减少，其中，10 mmol·L-1NAC处理后细胞内的ROS水平与对照组相比， 差异无统计学意义； 而阳性细胞数目和GFP表达量也随着NAC浓度的增大而逐渐减少.结果表明，H2O2通过ROS的形成介导促进rAAV2转导，减少rAAV2在细胞运输过程中的损失，从而促进了rAAV2的转导.

(a) 对照组 (b) H2O2 (c) H2O2+1 mmol·L-1 NAC

(d) H2O2+5 mmol·L-1 NAC (e) H2O2+10 mmol·L-1 NAC

(f) ROS定量分析 (g) 阳性细胞数目 (h) GFP荧光强度图8 ROS对rAAV2转导的影响Fig.8 Effect of ROS on rAAV2 transduction

3 结论

研究H2O2和Fe-NTA两种氧化应激对rAAV2体外转导的影响，实验结果显示，氧化应激能够促进rAAV2转导，在293T，LO-2，Hela和A549细胞中，其表达GFP细胞数、Gluc表达量、病毒基因组数等与对照组相比，差异均具有统计学意义；H2O2处理后，rAAV2在胞质内明显增多，且长时间聚集在核周围；当氧化应激产生的ROS被NAC清除时，H2O2促进rAAV转导作用明显减弱，说明ROS是H2O2促进rAAV转导的主要物质.

rAAV2进入细胞后首先被网格蛋白包裹进入细胞，形成早期内含体、晚期内含体、蛋白酶体，最终进入细胞核，脱壳、单链合成双链[14].氧化应激能够激活细胞中的p53，NF-κB，JNKNF-κB等信号通路，电离辐射、紫外线激活NF-κB，激活的NF-κB能够增强与DNA结合力和激活蛋白磷酸酶/激酶途径，促进rAAV2的转导，而NAC在电离辐射和紫外线暴露后能阻止NF-κB的活化，对rAAV2转导无明显作用[22]，电离辐射产生的ROS可能是促进rAAV2转导的主要因素.实验进一步证实，ROS越多，则促转导能力越强，ROS促使rAAV2在细胞核周围聚集的时间越长，说明ROS在rAAV2转导过程可以防止rAAV2被清除.

研究证实，H2O2和Fe-NTA氧化应激模型可促进rAAV2转导，促进转基因的表达、增加细胞中病毒基因组数目等，氧化应激产生的ROS可延长rAAV2在细胞核周聚集，延缓rAAV2的降解，揭示了氧化应激促使rAAV2转导的机制，为体外提高rAAV2转导提供方法.