左卡尼汀通过TGF-β1/Smad通路对尿毒症腹膜透析大鼠钙磷代谢的影响

程艳艳，周艳萍，曹仁智

（北大医疗鲁中医院重症医学科，山东临淄 255499）

尿毒症（Uremia）是慢性肾衰竭的终末阶段，水电解质紊乱和代谢性酸中毒合为其主要特征，同时伴有钙缺乏症和磷过多等症状[1]。腹膜透析（peritoneal dialysis, PD）为治疗终末期肾脏病的主要肾脏替代疗法之一，具有持续清除废物、对患者活动影响较小、治疗成本较低等优点[2]。然而，持续暴露于机械应力、葡萄糖透析液及导管并发症等可导致腹膜炎症和损伤，从而导致进行性血管生成和腹膜纤维化，进而导致超滤衰竭。左旋肉毒碱，又称左旋肉碱，主要分布在心脏和骨骼肌中，可用于促进体内脂质代谢，提高氧化分解能力，增强细胞活力，改善机体组织功能障碍。尿毒症在腹膜透析过程中造成左旋肉碱损失，一定程度地促进了超滤失败的发生。研究[3]显示，通过外源性补充左卡尼汀和左旋肉碱，可以改善腹膜透析患者机体的炎症和营养状况，有助于改善腹膜透析的效果，然而其分子机制尚不清楚。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）是慢性肾脏病的标志物。研究[4]发现，Sma 和Mad相关蛋白（Sma and Mad-related protein, Smad）是TGF-β1下游的信号转导蛋白，下调Smad 可以预防肾病小鼠肾衰竭[5]。本研究通过复制大鼠尿毒症腹膜透析模型，拟探讨左卡尼汀对尿毒症腹膜透析大鼠的肾脏损伤是否具有保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30 只SPF 级健康成年雄性SD 大鼠购自中国医学科学院动物实验中心[实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2018-0004]，体重（200±20）g。所有大鼠均在实验动物中心自由饮用食水，研究经医院动物实验伦理委员会批准。

1.2 试剂及药物

兔源一抗TGF-β1、二抗羊抗、Smad3、p-Smad3和GAPDH 均购自美国Abcam 公司，血肌酐和血尿素氮酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海明秀生物技术有限公司，DAB 显色试剂盒、BCA 蛋白质浓度测量试剂盒、聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒、蛋白质提取试剂盒均购自上海生工生物工程股份有限公司，大鼠甲状旁腺激素ELISA 试剂盒购自上海济宁酶有限公司。左卡尼汀口服液（规格：10 mL∶1 g）购自东北制药集团公司沈阳第一制药厂，低钙腹膜透析液2 000 mL（含1.5%葡萄糖）购自广州百特医疗用品有限公司。

1.3 模型复制方法

适应性喂养7 d 后，将大鼠麻醉，备皮并消毒左肾手术部位皮肤，切开1.5 cm 切口，剥离周围的脂肪组织，结扎上1/3 肾脏，切除1/3 肾脏并止血。采用相同的方法切除下1/3 肾脏，直至无出血，复原剩余左肾，缝合肌层和皮肤，采用青霉素消毒。7 d 后，采用相同方法进行右肾全肾切除术。2 d 后，断尾取血，检测血肌酐，当血肌酐水平超过2 倍正常值，表明尿毒症模型复制成功。尿毒症大鼠模型复制成功后，将腹膜透析管插入腹腔并注入2 mL 1.5%低钙腹膜透析液，1 次/d，直到尿毒症腹膜透析管通畅，表明尿毒症腹膜透析大鼠模型复制成功。将模型复制成功的大鼠随机分为模型组和左卡尼汀组，另将切开并剥离脂肪组织但不结扎肾脏，行腹腔插腹膜透析管处理的大鼠作为假手术组（对照组），每组10 只。模型组和对照组腹腔注射生理盐水1 mL/d；左卡尼汀组腹腔注射左卡尼汀40 mg/kg，1 次/d，持续6 周。然后切取实验所需的组织。

1.4 取材

给药前后称重。给药结束，各组大鼠均禁食但自由饮水1 d，麻醉下取尾静脉血，常温3 000 r/min离心，取血清，置于-20℃冰箱冷冻保存备用。实验结束后切取剩余肾脏组织，分离肾皮质，置于-80℃液氮，备用。

1.5 血生化指标检测

严格按照说明书进行操作，检测血清中肌酐、尿素氮、甲状旁腺激素、钙、磷水平。

1.6 肾脏组织TGF-β1/Smad通路相关蛋白检测

采用蛋白提取试剂盒提取储藏于-80℃液氮的大鼠肾脏组织的总蛋白，采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒法测定总蛋白浓度，采用凝胶电泳分离蛋白质，将其转移至PVDF 膜上，采用5%脱脂奶粉密封2 h，添加一抗TGF-β1、Smad3、p-Smad3，一抗的工作浓度均为1∶5 000，在4℃下孵育过夜，加入羊抗兔二抗，室温下孵育1 h，采用DAB 试剂显色，并用蛋白凝胶成像仪进行拍照和定量分析。以GAPDH 为内参。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠模型复制前后体重的比较

模型复制前，3 组大鼠体重比较，经方差分析，差异无统计学意义（P>0.05）。给药结束后，3 组大鼠体重比较，差异有统计学意义（P<0.05）；进一步两两比较，模型组和左卡尼汀组大鼠体重较对照组减轻（P<0.05），左卡尼汀组大鼠体重较模型组增加（P<0.05）。见表1。

表1 3组大鼠模型复制前后体重的比较（g，±s）

表1 3组大鼠模型复制前后体重的比较（g，±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

组别对照组模型组左卡尼汀组F 值P 值给药后384.24±15.83 287.13±13.67①321.83±12.73①②121.178 0.000模型复制前203.14±12.87 206.21±13.41 204.18±13.06 0.142 0.868

2.2 3组大鼠给药后血肌酐、尿素氮水平的比较

给药结束后，3 组大鼠的血肌酐、尿素氮比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）；进一步两两比较，模型组和左卡尼汀组大鼠血肌酐和尿素氮水平较对照组升高（P<0.05），左卡尼汀组大鼠血肌酐和尿素氮水平较模型组降低（P<0.05）。见表2。

表2 3组大鼠给药后血肌酐、尿素氮水平的比较（μmol/L，±s）

表2 3组大鼠给药后血肌酐、尿素氮水平的比较（μmol/L，±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

组别对照组模型组左卡尼汀组F 值P 值血尿素氮7.28±3.61 18.13±4.72①12.46±2.96①②20.047 0.000血肌酐27.14±5.83 68.31±9.72①43.27±5.86①②79.301 0.000

2.3 3 组大鼠给药后血甲状旁腺激素、钙、磷水平的比较

给药结束后，3 组大鼠的血甲状旁腺激素、钙、磷比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）；进一步两两比较，模型组和左卡尼汀组大鼠血甲状旁腺激素、磷水平较对照组升高（P<0.05），血钙水平降低（P<0.05），左卡尼汀组血甲状旁腺激素、磷水平较模型组降低（P<0.05），血钙水平较模型组升高（P<0.05）。见表3。

表3 3组大鼠给药后血甲状旁腺激素、钙、磷水平的比较（±s）

表3 3组大鼠给药后血甲状旁腺激素、钙、磷水平的比较（±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

组别钙/（nmol/L）磷/（nmol/L）对照组模型组左卡尼汀组F 值P 值甲状旁腺激素/（ng/L）324.16±66.82 483.17±72.09①403.11±70.82①②12.920 0.000 1.48±0.26 2.96±0.33①2.23±0.28①②64.453 0.000 2.73±0.37 1.72±0.24①2.16±0.31①②26.473 0.000

2.4 3组大鼠给药后肾脏TGF-β1/Smad通路蛋白相对表达量的比较

给药结束后，3 组大鼠TGF-β1和p-Smad3 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）；进一步两两比较，模型组和左卡尼汀组TGF-β1和p-Smad3 蛋白相对表达量较对照组升高（P<0.05），左卡尼汀组TGF-β1和p-Smad3 蛋白相对表达量较模型组下降（P<0.05）。3 组大鼠Smad3 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4和图1。

图1 3组大鼠给药后肾脏TGF-β1/Smad通路的蛋白表达

表4 3组大鼠给药后肾脏TGF-β1/Smad通路蛋白相对表达量的比较 （±s）

表4 3组大鼠给药后肾脏TGF-β1/Smad通路蛋白相对表达量的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

组别对照组模型组左卡尼汀组F 值P 值p-Smad3 0.26±0.06 0.48±0.12①0.37±0.09①②13.908 0.000 TGF-β1 0.31±0.07 0.62±0.14①0.42±0.11①②20.246 0.000 Smad3 1.06±0.25 1.02±0.18 0.97±0.24①②0.400 0.674

3 讨论

现有治疗条件下，终末期肾脏疾病患者必须依靠肾脏替代疗法才能生存[6]。在腹膜透析、血液透析及肾脏移植这3 种主要的替代疗法中，腹膜透析具有价格低廉、操作简便、对血流动力学的影响较小、对残余肾功能的保护更好等优点，因而成为终末期肾脏病患者的首选肾脏替代疗法[6]。然而，近期研究显示，随着腹膜透析时间的推移，腹膜纤维化引起的超滤衰竭发生率逐渐增加，找到减少尿毒症患者腹膜透析并发症并保护肾脏功能的治疗药物或干预手段尤为迫切且重要[7]。

左旋肉碱作为氧化脂肪酸的必需物质，分布于心脏和骨骼肌中，健康成人可以自身合成20 g 左右的左旋肉碱。左旋肉碱不仅能促进体内脂质代谢，还能在线粒体中产生短链酰基，促进线粒体基质同长链脂肪酸相结合，提高氧化分解的能力，增强细胞活力，改善机体组织功能障碍[8-9]。对慢性肾功能不全的患者，左旋肉碱的含量会明显降低，并且还会在透析过程中造成一定程度的损失，透析患者补充左旋肉碱对改善透析效果具有积极意义[10]。左卡尼汀是从哺乳动物中提取的能量代谢产物，属于维生素样营养素，即商业化的左旋肉碱。本研究采用左卡尼汀连续给药尿毒症腹膜透析大鼠6 周，结果显示，与对照组比较，模型组大鼠的体重降低，但与模型组比较，左卡尼汀组大鼠体重增加，提示左旋肉碱有助于改善尿毒症腹膜透析大鼠的体质。

肌酐是人体肌酸代谢的产物，血肌酐几乎全部经肾小球滤过进入原尿，不被肾小管重吸收，肌酐的每日生成量几乎恒定，因此血肌酐水平为稳定值，测定血肌酐浓度可以反映肾小球的滤过功能，成为衡量肾功能的重要指标[11]。肌酐对机体的肾损伤高度敏感，因此可以在肾损伤的早期对其进行评估。本研究显示，与对照组比较，模型组和左卡尼汀组大鼠血肌酐、尿素氮水平均升高，与模型组比较，左卡尼汀组大鼠血肌酐和尿素氮水平均降低，本研究结果与申屠伟丰[12]等的报道一致，提示左卡尼汀可改善肾小球滤过作用，降低腹膜透析大鼠血肌酐及尿素氮水平。

在慢性肾脏疾病患者中，随着肾纤维化的进展，肾脏排磷能力的下降，血磷的增加，1，25-（OH）2D3的生成减少，肠道对钙吸收下降，进而导致甲状旁腺功能障碍，导致血钙降低、血磷升高，血钙、血磷水平异常可诱发甲状旁腺功能亢进、肾骨病[13-15]。本研究显示，与模型组比较，左卡尼汀组大鼠血钙升高，血甲状旁腺激素、磷水平降低，提示左卡尼汀可改善肾小管功能，促进钙再吸收，强化肾功能促磷代谢，血钙水平的升高可激活负反馈机制，降低甲状旁腺激素水平。

研究表明，TGF-β1可增强胶原蛋白转换来刺激单层细胞修复，进而影响组织修复过程[16]。Smad的磷酸化可通过TGF-β1与膜表面受体的结合而被激活，激活的Smad 可调节靶基因转录[17]。Smad3 是Smad 家族的成员，并且已证明Smad3 促进慢性肾病中的细胞纤维化[18]。本研究显示，与对照组比较，模型组TGF-β1和p-Smad3 蛋白相对表达量升高，提示尿毒症腹膜透析大鼠TGF-β1/Smad 被激活，肾细胞纤维化程度增强，肾功能显著降低。给予左卡尼汀干预后，肾组织的TGF-β1和p-Smad3 蛋白相对表达量降低，可见左卡尼汀可通过抑制TGF-β1/Smad 信号通路活化而保护受损的肾脏。

综上所述，左卡尼汀可通过抑制尿毒症腹膜透析的TGF-β1/Smad 通路活化来改善肾脏功能，提高血甲状旁腺激素、钙、磷水平，改善钙磷代谢平衡。