一起聚集性发热伴血小板减少综合征病原S基因分子进化分析

何 敏,董晓庆,石利民,王雅倩,张守刚

发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一种以发热伴血小板、白细胞减少,严重者可出现出血和多器官功能障碍,甚至死亡的疾病。其致病原为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV),简称新型布尼亚病毒[1-2]。自2010年在我国河南、湖北等地出现后,各地报告的SFTS发病数逐年增加,并且多个省份发生SFTS 聚集疫情[3-5]。近年来,南京市报告的SFTS病例数明显高于以往[6],但聚集性案例鲜有发生。2020年4月南京鼓楼医院收诊了6例疑似一起聚集性SFTS疫情病人,对所有疑似病例进行SFTSV 核酸检测,阳性者扩增S基因片段、测序并开展序列比对、溯源分析,为进一步加强对SFTSV 感染监测和防控提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2020年4月15日南京市疾病预防控制中心收到南京鼓楼医院送检的6份急性期全血标本,根据临床特征和流行病学资料,疑似为一起聚集性SFTS事件。6例病人先后出现发热、血小板减少等症状,且有聚集史。南京市疾病预防控制中心收检样本后,立即开展检测。

1.2 仪器与试剂 荧光定量PCR 仪器(ABI Q5)、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR 法)(达安基因)、SP96全自动核酸提取仪(达安基 因)、One step RT-PCR kit(日 本TAKARA 公司)、Qiacel毛细管电泳仪(德国QIAGEN 公司),PCR 扩增仪(美国ABI公司)。

1.3 方 法

1.3.1 核酸检测 全血标本,3 000×g离心5 min,分离血清。吸取200μL血清,按试剂盒说明书提取病毒RNA,采用荧光定量PCR 法对所提核酸进行新型布尼亚病毒的检测,阳性标本核酸留存,实验设立阴性对照和阳性对照。

1.3.2 S基因的扩增和序列测定

1.3.2.1 引物设计与合成 根据SFTSV 的S基因特点自行设计片段引物。引物序列见表1。引物由上海英骏公司合成。

表1 S基因片段扩增引物Tab.1 Primers for amplification of the S gene fragment

1.3.2.2 病毒RNA 扩增和测序 以 提取的病毒RNA 为模板,进行一步法RT-PCR 扩增。RT-PCR反应条件为50 ℃,30 min,94℃2 min;94℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃1 min,35个循环;72 ℃10 min。使用Qiacel对扩增产物进行电泳,检测有无目的条带,随后送至上海生工生物有限公司进行纯化和测序。

1.3.2.3 基因测序及序列分析 用Dnastar中Seq-Man软件对测序结果进行拼接,获得S目的基因片段序列;应用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库对各样本S基因序列进行在线BLAST 比对,分析最大相似性株。文中涉及的其他地区SFTSV 相关参考株S基因序列从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank 中下载。采用Meg Aline法进行核苷酸序列同源性比较,MEGA5.2软件对S 基因核苷酸序列进行进化分析,用最大似然法构建系统进化树,可靠性分析采用Bootstrap法,循环次数设为1000。

2 结果

2.1 疑似聚集疫情病例关系特征 根据发病时间顺序对病例进行编号,1号病例,实验室标号Nanjing200415-3许某,男,35岁,农民,2020 年4 月1日发病,4月11日前往南京鼓楼医院就诊。后续2～6号病例2020年4月8日至4月11日期间相继发病并就诊。流行病学资料显示,1号病例发病前自述有蜱虫叮咬史,后续病例5例均无蜱虫叮咬史。2号、4号与1号病例存在亲属关系,3号、5号、6号自诉与1 号病例发生直接接触(血液),无其他SFTS确诊病例接触史。2例为当地农民,余3例为工人,工作地点不同,工作环境中不存在疾病传播媒介。2～6号病例发病时间集中,且有共同聚集、暴露史。初步考虑,该起疫情可能为一起直接接触1号病例导致的聚集性疫情。见表1。

2.2 SFTSV 核酸检测 采用实时荧光定量PCR法对送检的7例全血标本进行SFTSV 核酸检测。其中5例(样本号 Nanjing200415-1、Nanjing 200415-2、Nanjing200415-4、Nanjing200415-6、Nanjing200415-7)SFTSV 核酸检测阳性,CT 值分别为35.1、34.3、36.0、35.2、33.4,Nanjing200415-3 为 阴性。见表2。

表2 一起疑似聚集性SFTSV病例基本信息及核酸检测结果Tab.2 Basic information and nucleic acid test results of a suspected cluster of SFTV cases

2.3 SFTSV S基因片段同源性比较 5例核酸阳性(Nanjing200415-1、200415-2、200415-4、200415-6、200415-7)经RT-PCR 扩增,双向测序后,对所得目的片段S基因进行拼接。经分析比对,5例核苷酸高度同源,4例核苷酸同源性为100%,200415-2与其他4例核苷酸同源性为99.7%;与南京同期另一病例Nanjing200609-1 核苷酸同源性为95.2%;与GenBank下载的其他地区SFTSV 参考株的核苷酸同源性为93.8%～100%。经NCBI网站在线BLAST 比对,与此次疫情分离株S 基因片段核苷酸同源性最高的毒株为2014 年江苏地区分离株JS2014-06和2015年江苏地区分离株JS2015-26,核苷酸同源性为100%,见图1。

图1 Nanjing200415-1-5与其他SFTSV核苷酸同源性比较Fig.1 Homology comparison of nucleotides between Nanjing200415-1-5 and other SFTSV

2.4 SFTSV S片段进化分析 将5例SFTSV 南京株S 片段基因序列与从GenBank 获取的其他地区参考株进行遗传进化和种系分析。通过进化树可以看到,自2010年以来,江苏地区历年SFTS均有发生,基因型以C 型为主,C1、C2、C3、C4亚型均有发布。C分支内的中国各地区流行株间高度同源,未发现地区差异。此次聚集性疫情的5例SFTSV分离株在同一进化树C2 亚型分支上聚集成一簇,亲缘关系近;与2014年、2015年江苏及安徽的流行株、2010年江苏株、河南及安徽参比株形成遗传距离相近的一个C2 亚型小分支;一株近期(2020年6月份)南京株分布在C4 亚型分支上,在C1、C3 亚型分支没有分布。余日本和韩国毒株处于J基因型分支。见图2。

图2 2020年南京市一起聚集性SFTSV阳性株S基因系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of the Sgene of an outbreak of SFTSV positive strains in Nanjing in 2020

3 讨论

以往监测数据显示,近年来南京及周边地区发热伴血小板减少综合征(SFTS)本地病例数出现了大幅增长,发病呈逐年上升态势。但是一直以来江苏及周边地区SFTSV 聚集性疫情较少发生[6-7]。本次在较短时间、小范围内共计6人先后出现发热、血小板减少等SFTS典型临床症状[8]。根据«江苏省发热伴血小板减少综合征专项监测方案»规定,2周内,在同一村庄或在同一山坡等地劳动或旅游人员中,出现2 例及以上发热伴血小板减少综合征病例,或在病例密切接触者中出现类似病例,为聚集性病例。本次聚集性疫情的发生,进一步说明了我市及周边地区SFTSV 疫情形势日益严峻。

有研究表明蜱可能在该病的传播过程中发挥着重要作用[9],而聚集性疫情病例血液、体液、分泌物等可能是重要的传播因子[10-11]。此次事件中,1号病例自述蜱虫叮咬史,经带毒蜱类叮咬感染SFTSV,但其血液中SFTSV 核酸检测为阴性,推测可能原因为发病时间久,且经当地医疗机构抗病毒治疗。对此病例血清开展抗体补充实验,结果为Ig M 阴性,IgG 阳性,证实1号病例确为SFTSV 感染者,且已处于恢复期。2～6号病例SFTSV 核酸检测阳性,均有与1号病例有共同聚集、接触史,推测感染方式为在1号病例SFTSV 病毒载量较高的急性传染期内,接触其血液、分泌物或排泄物。

SFTS作为一种新发传染病,随着各地报告病例增加,国内外对SFTSV 分子流行病学及基因测序逐渐增多和深入[12-14]。SFTSV 根据S片段基因序列分子特征可分为C 和J两种基因型,其中C 基因型分为C1～C4 4种亚型[14-15]。李志锋等研究表明,我国东部地区目前主要为C 基因型,江苏和安徽优势流行株为C2 和C4 亚型,同时存在少量的C1和C3亚型流行[16]。系统进化树分析显示,本次疫情病例均属于C2 基因亚型,与江苏北部及安徽地区属同一分支,遗传进化距离较近;与国内其他分离株及日本、韩国分离株不在同一分支,差异较大。从进化树中还可以看出,从2010年以来,江苏分离株广泛分布于C2 亚型分支,不同年份毒株间亲缘关系近,遗传进化速度较为缓慢。另有一部分江苏流行株分布于C4亚型分支,本次事件同时期Nanjing200609病例属于C4亚型分支,说明南京地区同一时期SFTSV 流行株分子亚型并不单一,为C2亚型和C4亚型共流行状态。有研究发现,SFTSV 基因型可能与病例严重程度相关,SFTSV 感染死亡病例多为C2基因亚型[17]。本次聚集性疫情病原传染性强,病例症状较严重,进一步佐证了这一研究。

目前尚无针对SFTSV 的特效药物,也无有效疫苗可以接种[18]。因此,需积极开展广泛宣传,针对南京市SFTS流行区重点人群,普及防治知识,提高民众防病意识。同时,加强对SFTS监测,通过对SFTSV 分子水平研究,掌握我市SFTSV 基因型流行特征以及遗传进化特点,为南京地区SFTS防控提供科学数据支撑。

利益冲突:无

引用本文格式:何敏,董晓庆,石利民,等.一起聚集性发热伴血小板减少综合征病原S基因分子进化分析[J].中国人兽共患病学报,2022,38(6):502-506.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.068