纳米氧化铜与纳米氧化铁悬浮液对黄瓜霜霉病的抗性与防效

王志恒，韩家晨，徐雯琦，陈晓峰

(中国农业大学 烟台研究院，山东 烟台 264670)

0 引言

【研究意义】黄瓜是南北方广泛种植的蔬菜作物，种植过程中极易受病虫害危害，尤以真菌病害的影响最严重，其中较常见的病害有霜霉病〔Pseudoperonosporacubensis(Berk.et Curt.)Rostov.〕、蔓枯病〔Mycosphaerellamelonis(Pas.)Chiu et walker.〕、炭疽病〔Colletotrichumorbiculare(Berk aLMont) Arx.〕和白粉病〔ErysiphecichoracearumZheng & Chen,Sphaerothecacucurbitae(Jacz.) Z.Y.Ahao〕[1-2]。霜霉病又称跑马干，是一种通过空气传播的毁灭性叶部病害，发生于黄瓜苗期至成熟期，发病后若控制不当，易导致黄瓜大量减产甚至绝收，严重威胁黄瓜的安全生产。目前采取的主要防止手段是品种更新和药物防治[3-5]，药物以化学农药为主，但长期使用易造成病毒的耐药性增强，且会带来一系列环境问题[6]。所以，减少低效、高毒且高残留化学农药的使用，寻求新型防止药物是农业现阶段发展的必由之路，对蔬菜安全生产和农业绿色生态具有重要现实意义。【前人研究进展】纳米材料被誉为21世纪的“高科技材料”，其对促进植物生长和提高植物抗病性有显著作用。SWIFT等[7]研究发现，纳米二氧化钛(5 nm)可以促进光吸收，植物的光合效率提高9.8%～21.6%。WANG等[8]报道，纳米银(5 nm、10 nm)使用浓度为 0.01 mg/L和0.05 mg/L时能够促进拟南芥的生长；纳米银(25 nm)使用浓度为 1 mg/L时可促进杨树生长。ADISA等[9]研究发现，纳米二氧化铈(8 nm)能抑制番茄枯萎病的发生并提高植物叶绿素含量。王志静等[10]认为，纳米银(10 nm)和纳米铜(10 nm)的单剂防治柑橘青霉菌有明显效果，其EC50分别为2.456 6 mg/L和1.196 2 mg/L。王运强等[11]研究发现，低浓度纳米氧化铜对西瓜幼苗生长有显著调节作用。刘振国等[12]报道，纳米氧化铜处理紫花苜蓿根系的SOD、POD及CAT等抗氧化酶活性达最高，对根系活力影响显著。邱凌之等[13]研究发现，50 mg/L纳米氧化铁对番茄具有促生长效应。【研究切入点】国内外学者围绕纳米材料生理效应进行了大量研究，然而运用纳米材料针对黄瓜霜霉病防治方面的相关研究尚不多见。【拟解决的关键问题】在黄瓜真叶期采用叶面喷雾法，研究不同浓度纳米氧化铜(CuO NPs)和纳米氧化铁(Fe2O3NPs)悬浮液喷施后再接种霜霉病病原菌黄瓜叶片丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和叶绿素(Chl.a+Chl.b)含量的变化，以及对黄瓜霜霉病的防治效果，以期为黄瓜生产中应用纳米材料防控黄瓜霜霉病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 黄瓜 品种为津春四号，中国农业大学烟台研究院提供。

1.1.2 药剂 纳米氧化铜(CuO NPs，20 nm)、纳米氧化铁Fe2O3NPs，20 nm)，购自上海攀田粉体材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

1) 育苗。黄瓜种子采用55℃温水进行温汤浸种，穴盘育苗，待植株长至4叶一心时选择长势一致、健壮且无病的幼苗备用。

2) 霜霉病病原菌(Pseudoperonosporacubensis)接种液制备。试验于2021年2—6月在中国农业大学烟台研究院进行。从日光温室内取回自然发病的黄瓜霜霉病病叶，在适宜条件下用毛刷子蘸取无菌水刷取发病黄瓜叶片上新鲜的分生孢子，纱布过滤后用无菌水稀释，在显微镜下计数制成浓度为1×106个/mL的分生孢子悬浮液。

3) 纳米悬浮液制备。根据王建荣等[14]的方法，在超纯水中按比例分别加入CuO NPs (A)和Fe2O3NPs (B)颗粒，超声1.5 h制备成浓度为10 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的悬浮液，备用。

1.2.2 试验设计 试验设7个处理，根据CuO NPs 和Fe2O3NPs 的处理浓度(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)分别设3个处理(A1～A3和B1～B3)，以喷施超纯水作对照(CK)，每处理6株幼苗，3次重复。用微型喷雾器将纳米材料悬浮液均匀喷洒在叶片正反面，每处理约用悬浮液40 mL，喷洒至悬浮液即将开始滴落为止；24 h后再将病原菌接种液均匀喷洒到黄瓜叶片背面，每处理约需接种液15mL，喷洒至悬浮液即将开始滴落为止；套黑色塑料袋在25～28℃黑暗环境中保湿48 h后去袋。

1.2.3 指标测定

1) 发病情况。在病原菌接种7 d后对黄瓜霜霉病发病情况进行调查。参照中华人民共和国国家标准《农药田间药效试验准则(一)杀菌剂防治黄瓜霜霉病》[15]规定的病害调查分级标准，各小区随机取4个样点，每点调查2株黄瓜，每株调查全部叶片。根据病斑面积占整个叶面积的百分率分级：0级，无病斑；1级，病斑面积占整片叶面积的5%以下；3级，病斑面积占整片叶面积的6%～10%；5级，病斑面积占整片叶面积的11%～20%；7级，病斑面积占整片叶面积的21%～40%；9级，病斑面积占整片叶面积的40%以上。根据所得数据计算病情指数和防治效果。

病情指数=∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)×100%

防治效果=[1-(CK0×PT1)/(CK1×PT0)]×100%

式中，CK0为对照组施药前的病情指数，CK1为对照组施药后的病情指数，PT0为试验组施药前的病情指数，PT1为试验组施药后的病情指数。

2) 丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量。参照李合生等[16-18]的方法，分别在接种病原菌0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后随机选择黄瓜叶片，测定丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量。

3) 叶绿素含量。参照LICHTENTHALER[19]的紫外吸收法进行测定。首先，在接种病原菌14 d后取50 mg新鲜黄瓜叶片样品，切成约1 cm的碎块，加入15 mL试管中，用10 mL丙酮-乙醇提取液(V∶V=1∶1)进行修正，加塞。然后在黑暗避光中保存72 h，用紫外可见分光光度计在波长664.2 nm和664.2 nm分别测定吸光度值(A)，计算叶绿素A、叶绿素B和总叶绿素含量。

叶绿素A含量=13.36A664.2-5.19A648.6

叶绿素B含量=27.43A648.6-8.12A664.2

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2016记录数据并计算绘图；采用SPSS 26.0对试验数据进行Duncan’s新复极差法比较和差异显著性检验(P≤0.05)。

2 结果与分析

2.1 2种纳米材料处理黄瓜叶片霜霉病的病情指数及防治效果

从表1看出，CuO NPs和Fe2O3NPs悬浮液处理黄瓜霜霉病的病情指数和防治效果均存在差异。

2.1.1 病情指数 CuO NPs处理的黄瓜霜霉病病情指数为2.03～4.68，Fe2O3NPs处理的病情指数为2.90～4.63。表明，2种纳米材料处理黄瓜霜霉病的病情指数均显著低于CK(12.73)。

2.1.2 防治效果 CuO NPs处理的防治效果为40.75%～72.23%，随CuO NPs浓度增大防治效果呈先升后降趋势，表现为A2>A3>A1。其中，A2的防治效果最好，为72.23%，显著高于A1和A3，较A1提高31.48百分点；A3的防治效果为51.46%，较A2降低20.77百分点，且叶片出现发黄萎蔫。Fe2O3NPs处理的防治效果为58.73%～71.24%，随Fe2O3NPs浓度增大防治效果呈逐渐上升趋势，表现为B3>B2>B1。其中，B3的防治效果为71.24%，较B1和B2分别提显著高12.51百分点和10.84百分点；B1与B2的防治效果差异不显著。表明，50 μg/mL CuO NPs和100 μg/mL Fe2O3NPs 的防治效果最好。

表1 不同纳米材料处理黄瓜霜霉病的病情指数及防治效果

2.2 2种纳米材料处理黄瓜叶片的MDA含量

由图1可知，2种纳米材料处理不同时段黄瓜叶片的MDA含量存在差异。

2.2.1 CuO NPs 在接种霜霉病病原菌后CuO NPs各处理的MDA含量随时间延长均呈上升趋势，且均在96 h时达最高。0 h时各处理的MDA含量表现为CK>A1>A3>A2，其余时段均表现为A3>CK>A1>A2，A1和A2的MDA含量较CK低，A2较A1低，说明10 μg/mL和50 μg/mL纳米悬浮液对黄瓜霜霉菌有较好的抑制效果，且50 μg/mL的抑菌效果更加明显。

2.2.2 Fe2O3NPs 在接种霜霉病病原菌后Fe2O3NPs各处理的MDA含量随时间延长均呈上升趋势，且在96 h时达最高。0 h时各处理的MDA含量均表现为CK>B1>B2>B3，且同一浓度处理72 h与96 h的MDA含量无显著差异(除处理B3间差异显著外)；48 h及以后，同一时段下随着Fe2O3NPs浓度增大，MDA含量均较CK显著降低。当Fe2O3NPs浓度为100 μg/mL时，接种病原菌96 h后，黄瓜叶片中MDA含量较CK降低43.3%。

注：图中不同小写字母表示各处理间差异显著 (P≤0.05)。下同。

2.3 2种纳米材料处理黄瓜叶片的GSH含量

由图2可知，2种纳米材料处理不同时段黄瓜叶片的GSH含量存在差异。

2.3.1 CuO NPs 各处理不同时段黄瓜叶片GSH含量均随CuO NPs浓度升高呈先升后降趋势，表现为A2>A1>A3>CK；在0 h之后各处理GSH含量与CK均差异显著，其中，A2的GSH含量提升最明显，A1次之，A3的效果最差且在处理48 h时叶片出现萎蔫发黄现象。随处理时间延长，CK的GSH含量呈逐渐下降趋势，A1、A2和A3的GSH含量均呈先升后降趋势，均在72 h达峰值，随后迅速下降，96 h时GSH含量与48 h时的水平接近。

2.3.2 Fe2O3NPs 各处理不同时段黄瓜叶片GSH含量呈现与CuO NPs处理不同的上升趋势，即前72 h GSH含量呈显著上升趋势，但96 h时各处理的GSH含量与72 h时无明显变化。0 h之后各处理GSH含量均表现为B3>B2>B1>CK；随处理时间延长，CK和B1的GSH含量呈逐渐下降趋势，B2和B3的GSH含量均呈逐渐上升趋势。与CK相比，B1的GSH含量较CK略有提高，B2和B3较CK提高显著。说明霜霉病菌的侵染造成黄瓜叶片GSH含量的下降，B1能缓解病原菌侵染造成的GSH含量下降，而B2和B3的GSH含量显著上升，且后者作用效果更明显。

图2 纳米氧化铜和纳米氧化铁处理黄瓜叶片的GSH含量

2.42种纳米材料处理黄瓜叶片的叶绿素含量

从表2看出，2种纳米材料处理14 d后黄瓜叶片叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量的变化。

2.4.1 CuO NPs 各处理黄瓜叶片的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量分别为0.742～1.043 mg/g、0.196～0.372 mg/g和0.938～1.415 mg/g，均表现为A1>A2>CK>A3，即随处理浓度升高叶绿素含量呈先升后降趋势。其中，A1最高，A2其次，二者差异显著，且均显著高于CK，说明该浓度处理对霜霉病病菌有抑制作用，且在A1时更有利于叶绿素的合成。A3黄瓜叶片的叶绿素a含量显著低于CK，下降9.842%；其叶绿素b和总叶绿素含量均较CK低，分别下降7.981%和9.459%，但差异均不显著。

2.4.2 Fe2O3NPs 各处理黄瓜叶片的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量分别为0.903～1.174 mg/g、0.270～0.362 mg/g和1.173～1.536 mg/g，均表现为B2>B3>B1>CK，即随处理浓度增大黄瓜叶绿素含量呈显著上升趋势，未出现中高浓度抑制的现象。其中，B3最高，显著高于其余处理；B2其次，显著高于B1和CK。B3黄瓜叶片的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量较CK分别上升62.69%、69.95%和48.36%，说明，霜霉病病原菌侵染对叶绿素含量的影响受到明显抑制。

表2 纳米氧化铜和纳米氧化铁处理黄瓜叶片的叶绿素含量

3 讨论

当前蔬菜病害已成为制约蔬菜产业发展的重大问题，其中卵菌门病害对蔬菜生产造成的损失尤为严重，特别是黄瓜霜霉病菌对一般化学药剂已普遍产生抗药性[20-21]，致防治困难。研究发现，CuO NPs和Fe2O3NPs对黄瓜霜霉病均具有良好的抑制效果。不同浓度CuO NPs和Fe2O3NPs悬浮液处理可降低黄瓜叶片的病情指数，且在一定浓度范围内，浓度越大效果越明显。但100 μg/mL CuO NPs悬浮液处理叶片出现萎蔫现象，究其原因是过高浓度的纳米材料对黄瓜具有细胞毒性，与张慧玲[22]研究的高浓度纳米材料对植物有负面效应的结论一致。

丙二醛(MDA)含量通常表示膜脂过氧化程度和膜的损伤程度[11]，膜脂过氧化程度越剧烈，MDA含量越高，则膜损伤越大。随着CuO NPs和Fe2O3NPs悬浮液处理时间的增加，黄瓜叶片的MDA含量较CK逐渐下降，膜系统受损程度和膜脂过氧化程度较CK下降；谷胱甘肽(GSH)被认为是植物活细胞体内最重要的氧化还原缓冲剂，对应急条件下高活性氧水平和产生的氧化应激和损伤进行解毒[23]。试验中GSH含量较CK逐渐提高，但CuO NPs处理96 h时的GSH含量呈下降趋势，而Fe2O3NPs处理未出现下降趋势，与赵铭等[24]的研究即多种酶联合作用清除活性氧导致酶含量降低的结果一致。与Fe2O3NPs处理不同的是，当CuO NPs悬浮液处理浓度过高时，抗氧化酶系活力升高[12]，纳米材料对黄瓜叶片产生的氧化胁迫相应增加，在100 μg/mL时对黄瓜叶片造成氧化损伤，伤害植株。

研究结果表明，一定浓度纳米材料处理后可提高叶绿素含量，其中10 μg/mL CuO NPs和100 μg/mL Fe2O3NPs悬浮液处理的效果最好，而100 μg/mL CuO NPs悬浮液处理黄瓜叶片出现黄化萎蔫现象，说明100 μg/mL CuO NPs悬浮液已对黄瓜叶绿素合成产生抑制，高浓度纳米悬浮液的积累对黄瓜生长产生毒害，与王发园等[25-26]的研究结果相似。所以，黄瓜叶片对纳米氧化铜的耐性比对纳米氧化铁的耐性更弱，此结果进一步验证杨远强[27]对CuO NPs在植物耐性中的研究结果。目前还无法准确判断黄瓜对CuO NPs和Fe2O3NPs的耐受特性是否高于其他纳米材料，未来将继续开展试验及细胞学相关研究。

4 结论

CuO NPs和Fe2O3NPs有效减轻黄瓜霜霉病的发生，在适宜浓度范围内，CuO NPs和Fe2O3NPs的防效分别为40.75%～72.23%和58.73%～71.24%；同时，除100 μg/mL CuO NPs处理外，二者均可提高病菌侵染后的叶绿素含量和GSH含量(除CuO NPs处理GSH含量在病原接种后96 h受抑制外)，降低MDA含量，能促进黄瓜光合作用及降低膜脂过氧化程度。其中，50 μg/mL CuO NPs和100 μg/mL Fe2O3NPs对黄瓜霜霉病病原菌的抗菌效果最佳；100 μg/mL CuO NPs悬浮液处理对黄瓜叶片产生毒害，进而对霜霉病菌的抑制效果显著减弱。在施用时应根据种植条件控制施药浓度，避免施加纳米氧化铜浓度过大对黄瓜生长产生损害，影响施用效果和产品收益。