FaGST基因过量表达获得拟南芥转基因植株

陈 锡，陈 莹，刘晓霞，刘重阳，吴 溪，姚文琴，王小利*

(1.贵州省草业研究所，贵州 贵阳550006； 2.贵州大学 生命科学学院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室/喀斯特山区植物资源利用与育种国家地方联合工程研究中心，贵州 贵阳550025)

0 引言

【研究意义】谷胱甘肽转移酶(glutathione transferases，GSTs)普遍存在于动物、植物和微生物中，是一个庞大的超基因家族编码的多功能性酶。GST在植物中最早被发现，是因为其对除草剂具有解毒作用，随着GST被大量发现，GST的其他功能也逐渐被人们知悉。GST具有催化活性和非催化活性功能，催化活性是GST以某些物质或谷胱甘肽(GSH)为底物，以各种酶及脱谷胱甘肽等形式进行酶催化反应，形成复合物，将有害物质运输至体外，从而起到解毒作用[1]；非催化活性是GST参与细胞内激素、次生代谢物等合成和运输，在植物生长发育和次生代谢等过程中发挥重要作用[2]。研究GST对植物生长和抵御胁迫的分子机制，对改善或提高植物受胁迫能力具有重要的现实应用意义。【前人研究进展】JIA等[3-4]研究表明，GST在植物体中表达受盐和重金属的胁迫。当植物遭受逆境胁迫时，GSTs通过解毒和抗氧化作用避免植物细胞免受逆境伤害[1]。刘兴凤[5]研究发现，浒苔在温度、盐度、光照和紫外光等逆境胁迫下GST的表达量提高，推测这是导致浒苔爆发成为黄海绿潮的重要因素之一。杨舒涵等[6]研究表明，在镉胁迫下能源甜菜BvGST基因发挥着重要的解毒作用，可能是因为GST通过氧化逆境进行活性解毒，从而影响其细胞对重金属镉离子的代谢调控。梁志乐等[7]研究发现，大蒜AsGST基因可能与耐盐性有密切关系，在植物抵御盐胁迫机制中发挥重要调控作用。【研究切入点】目前，鲜见关于FaGST基因抗盐及解毒性功能的研究报道。利用前期成功构建的带有潮霉素特异基因空载体和FaGST基因过量表达载体，通过花序浸染法，以获得转基因拟南芥植株，经PCR验证，利用实时荧光定量PCR技术分析其表达量。【拟解决的关键问题】探明FaGST基因的功能和分子调控机制，以期为其后期的抗性利用与研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 种子 拟南芥品种为哥伦比亚(Col)，其种子由武汉转导生物实验室提供。

1.1.2 菌株、载体及引物 大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌农杆菌GV3101(Agrobacteriumtumefaciens)和pCAMBIA1300-35S载体，均由武汉转导生物实验室提供；试验采用引物序列见表1。

表1 试验采用的引物序列

1.1.3 试剂、酶及仪器 植物DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；卡那霉素(Kan)、潮霉素(Hyp)、DNA Marker 2000、RNA反转录试剂盒和2X SYBR Green qPCR Master Mix，均购自安诺伦(北京)生物科技有限公司；TB1213核酸分析仪，购自广州硕谱生物科技有限公司；A28132荧光定量PCR仪，Thermo Fisher Scientific。

1.2 方法

1.2.1 转基因拟南芥植株的培养 采用花序侵染方法进行，将泥炭土∶蛭石=1∶1的基质混匀置于含有足够营养液的托盘中，土壤吸水潮湿后，水盘中剩余少量水为宜，将拟南芥种子点播于营养土中，置于人工气侯室培养。培养条件：温度(22±2)℃，湿度65%，光照16 h，黑暗8 h，培养至开花期备用。利用实验室前期成功构建的空载体pCAMBIA1300-35S和过表达载体pCAMBIA1300-35S-FaGST(均含植物体内没有的特异基因潮霉素)(图1)菌液，LB培养菌液，收集菌体重置于5%的蔗糖溶液(现配现用)，加入0.01%的表面活性剂silwet L-77，去除已结实的荚果，将花序浸入菌液中60 s，保湿过夜，7 d后再次转化，待结荚成熟时收种。将种子用次氯酸钠消毒2 min，用无菌牙签接种于含50 mg/L卡那霉素(kan)和30 mg/L潮霉素(Hyp)的MS培养基中，4℃倒置2 d，光照培养箱里正置培养约7 d，挑选生长健壮的无菌苗移栽至营养土中，培养收取T1代种子，再经潮霉素筛选继续种植收取T2代种子，最后收到T3代纯合种子。

注：A为空载体pCAMBIA1300-35S，B为过表达载体pCAMBIA1300-35S-FaGST。

1.2.2 转基因拟南芥植株的鉴定 以获得的拟南芥转基因植株嫩叶总DNA为模板，利用潮霉素hpt基因对获得转基因拟南芥植株进行PCR检测。剪取T3代转化植株叶片，称取100 mg鲜重，利用CTAB法提取DNA，设计NPTII特异引物进行PCR检测。PCR体系：DNA模板1 μL、10×PCRbuffer 2 μL、dNTP mixture (2 mmol/L each) 0.4 μL、NPTII-F Primer (10 μmol/L) 0.2 μL、NPTII-R Primer (10 μmol/L) 0.2 μL、rTaq DNA 聚合酶 (1 U/μL) 0.2 μL、ddH2O 16 μL。PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，25℃ 1 min，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 转基因拟南芥总RNA提取及 cDNA合成 根据RNA试剂盒操作说明提取拟南芥叶片总RNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测；按照反转录试剂盒的操作说明合成cDNA第一链。

1.2.4 转基因拟南芥荧光定量分析 根据FaGST基因序列设计荧光定量特异引物FaGST-F和FaGST-R。利用实时荧光定量PCR技术分析拟南芥转基因植株中FaGST基因的表达量，以野生型拟南芥(WT)植株表达量(1.00)为对照。操作步骤参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行。以拟南芥actin为内参基因，引物序列为actin-F和actin-R。总体系20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL、FaGST-F(10 μmol/L)0.5 μL、FaGST-R (10 μmol/L)0.5 μL、cDNA模板 1 μL、ddH2O 8 μL。反应液全程冰上配制，置于实时荧光定量PCR仪Applied BiosystemsTMQuantStudioTM3 & 5上进行反应。反应程序为95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，40个循环。拟南芥FaGST基因的相对表达量利用2-ΔΔct计算。

1.3 数据处理

采用Excel 2007处理数据与制图。

2 结果与分析

2.1 FaGST基因转化拟南芥植株的鉴定

从图2看出，经PCR检测后有6株空载体转基因阳性植株和8株转FaGST基因拟南芥阳性植株出现明亮条带，野生型拟南芥植株(WT)无条带，表明已成功获得拟南芥转基因纯合植株。野生型拟南芥植株形态和转FaGST基因拟南芥植株形态见图3。

注: B为空白对照，N为阴性对照，P为阳性对照。

图3 野生型(WT)与转FaGST基因(35S:FaGST)拟南芥植株

2.2 转基因拟南芥的FaGST基因表达量

从图4看出，6株(E1～E6)转空载体基因拟南芥植株FaGST基因的相对表达量变化不明显，为1.03～1.08，与野生型拟南芥植株基因表达量(1.00)相近，差异不显著；8株转基因拟南芥植株(T1～T8)FaGST基因的相对表达量均明显提高，为1.31～2.06；T1、T2、T5和T6显著高于WT，T3、T4、T7和T8极显著高于WT，说明FaGST基因在拟南芥中已过量表达。

注： WT为野生型植株表达量，T1～T8为转FaGST基因拟南芥植株表达量，E1～E6为转空载体基因拟南芥植株表达量；*、**分别表示转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量较野生型植株差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

3 讨论

逆境胁迫对植物生长发育具有一定的影响，谷胱甘肽作为二硫还原剂，调控由逆境所引起的逆境相关基因表达，其中GSTs具有重要作用[8]。LIU等[9-10]研究表明，GSTs对植物具有一定程度抵御胁迫的作用，如大豆GmGSTL1基因在烟草中过表达提高BY-2细胞数量，在盐胁迫下转大豆GmGSTL1基因提高拟南芥的存活率和增强了抗性。XU等[11]报道，番茄GST基因在拟南芥植物中过表达，其在盐胁迫和干旱胁迫条件下的生长情况变好。梁志乐等[7]研究表明，GST参与植物抵御盐胁迫的具体途径可能是通过将盐胁迫产生的有毒害作用的活性氧还原，从而减少对细胞结构和功能的损坏，保护细胞免受氧化损伤。陈锡等[12]研究发现，高羊茅FaGST1基因位于细胞核，在干旱、高温、高盐胁迫和低氮胁迫下均出现抑制表达。表明，GST促使植物抵御胁迫，具有响应生物和非生物胁迫的功能。因此，研究GST有助于阐明植物生长和抵御胁迫的分子机制，对胁迫植物生存能力的改善具有现实意义。

研究结果表明，经PCR检测后有6株空载体转基因植株和8株转FaGST基因拟南芥植株出现明亮条带，野生型拟南芥植株(WT)则无条带，成功获得拟南芥转基因纯合植株，6株转空载体基因拟南芥植株FaGST基因表达量变化不大，与WT表达量相近；8株转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量明显提高，且与WT差异显著或差异极显著。说明该基因在拟南芥中已过量表达，可为后期FaGST基因的抗性研究提供理论依据。

4 结论

利用空载体pCAMBIA1300-35S和已构建成功的过表达载体pCAMBIA1300-35S-FaGST导入农杆菌中，通过花序侵染法进行转基因拟南芥植株的培养，得到6株转空载体基因拟南芥植株FaGST基因表达量变化不大，且与野生型拟南芥植株(WT)表达量相近，8株转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量明显提高；成功获得拟南芥转基因纯合植株，FaGST基因在拟南芥植株中已过量表达。