2017—2019 年北京市东城区流感流行病学特征分析

李姗姗，李艳宇，孙冰洁，杜嘉鑫

北京市东城区疾病预防控制中心，北京 100010

流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒，是引起流行性感冒的病原体，曾多次引发全球范围内大流行，导致全球流感发病率和死亡率大幅增加［1］。根据膜蛋白与核蛋白的差异，将流感病毒分为甲、乙、丙3 型，甲型流感病毒根据外膜HA 和NA 蛋白抗原性的不同可分为多种亚型［2-3］。目前，流感病毒的主要检测方法包括分子生物学法、分离培养法、血清免疫学法，其中病毒分离培养法是流感病毒检测的金标准［4-5］。本研究采用实时荧光定量法检测病毒核酸，再应用病毒分离培养技术检测2017 年4 月— 2019 年3 月流感季北京市东城区两个国家级监测点的流感样病例，分析该地区流感流行病学特征，以期为流感的防治工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1样本 2017 年10 月— 2019 年3 月流感季北京市东城区第六医院和东直门医院两个国家级流感监测点的发热门诊和儿科流感样病例的咽拭子。

1.2细胞 MDCK 细胞由中国国家流感中心提供。

1.3鸡胚 SPF 级鸡胚，9 ～11 日龄，购自北京金源利恒生物技术有限公司，动物合格证号为：SCXK（京）-20190007。

1.4主要试剂 核酸提取试剂盒购自美国ABI 公司；流感甲型和乙型核酸检测试剂盒、甲型H1N1 和H3N2检测试剂盒、乙型流感BV 和BY 核酸检测试剂盒购自江苏硕世生物科技有限公司；流感病毒标准参照抗原及参照血清由中国国家流感中心提供。

1.5样本前处理 采用振荡器振荡咽拭子，将样本液混匀，用无菌镊子取出棉拭子时在管壁反复挤压拭子头部，于4 ℃静置5 ～10 min；待自然沉淀，取3 mL上清，分装至3 个冻存管。

1.6检测方法

1.6.1实时荧光定量核酸检测 取1 支冻存管样本，采用核酸提取试剂盒提取样本核酸，通过流感甲型和乙型核酸检测试剂盒、甲型H1N1 和H3N2 检测试剂盒、乙型流感BV 和BY 核酸检测试剂盒检测样本中相应目的核酸片段。

1.6.2流感病毒的分离培养及鉴定

1.6.2.1组织培养法 将核酸检测阳性样本接种至融合度达75%～90%的MDCK 细胞，于33 ～35 ℃培养箱培养，每日观察细胞病变情况，当75%～100%细胞出现病变时，反复冻融1 ～2 次，收获；无细胞病变培养物培养7 d 时收获［6］。收获的培养物进行红细胞凝集试验，选取血清凝集滴度≥16 的毒株进行红细胞凝集抑制试验鉴定流感病毒型别，将血凝滴度≤8 的毒株继续传代2 ～3 代，血凝滴度仍未达16 则记为阴性。

1.6.2.2鸡胚接种法 取核酸检测CT值＜28 的样本进行过滤，取200 μL 过滤液接种至鸡胚尿囊腔，每个样本接种3 个鸡胚，每日观察鸡胚生长情况，弃24 h 内死亡鸡胚，甲型流感病毒培养2 d，乙型流感病毒培养3 d；4 ℃放置过夜；收获尿囊液，经1 000 × g离心5 min，去血液和细胞，进行红细胞凝集试验，选取血清凝集滴度≥16 的毒株进行红细胞凝集抑制试验鉴定流感病毒型别，将血凝滴度≤8 的毒株继续传代2 ～3 代，血凝滴度仍未达16 则记为阴性。

1.7统计学分析 应用Excel 2007 软件建立数据库，SPSS 21.0 软件进行统计学分析，采用率对资料进行统计学描述，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1流感病毒监测概况 2017 年10 月— 2019 年3 月，两个流感季北京市东城区共完成3 420 份流感样病例咽拭子样本的检测，获得阳性样本465 份，阳性率13.60%（465 ／ 3 420）。其中甲型流感阳性336份，阳性率9.82%（336 ／ 3 420），乙型流感阳性129份，阳性率3.77%（129 ／ 3 420），甲型H1N1 阳性203 份，阳性率5.94%（203 ／ 3 420），甲型H3N2 阳性133 份，阳性率3.89%（133 ／ 3 420），乙型BV 阳性13 份，阳性率0.38%（13 ／ 3 420），乙型BY 阳性116 份，阳性率3.39%（116 ／ 3 420）。

2.2实时荧光定量核酸检测结果

2.2.1时间分布 2017 年4 月— 2019 年3 月，北京市东城区流感样病例咽拭子样本核酸检测阳性率呈季节性变化，2017 年35 周至38 周有1 个小高峰，第1 个流感季高峰期从2017 年48 周持续至2018 年7 周；第2 个流感季高峰期从2018 年52 周持续至2019 年10 周。其中，2017—2018 流感季甲型H1N1、甲型H3N2 和乙型BY 的检出率较高，分别为5.56%（99／1 780）、4.27%（76／1 780）、5.79%（103／1 780），乙型BV 的检出率最低为0.45%（8／1 780）；2018—2019 流感季甲型H1N1 检出率较高，为6.34%（104 ／1 640），甲型H3N2、乙型BY 和乙型BV 检出率较低，分别为3.48%（57 ／ 1 640）、0.79%（13 ／ 1 640）、0.30%（5 ／ 1 640）。见图1。

图1 2017 — 2019 年北京市东城区流感样病例咽拭子核酸阳性样本的时间分布Fig.1 Time distribution of pharyngeal swab samples positive for nucleic acid of influenza-like cases in Dongcheng District，Beijing from 2017 to 2019

2.2.2人群分布

2.2.2.1年龄分布 2017 年4 月—2019 年3 月，北京市东城区流感样病例咽拭子阳性样本中，＞59 岁年龄组阳性率最高，为17.05%（66／387），0 ～4 岁年龄组最低，为6.71%（31／462），＞4 ～14、＞14 ～24、＞24 ～59 岁年龄组阳性率分别为14.36%（170／1 184）、15.43%（48／311）、14.13%（152／1 076），不同年龄组间差异有统计学意义（χ2=24.23，P＜0.001）。0～4、＞4～14、＞24～59 岁年龄组甲型H1N1 的阳性率最高，＞14 ～24 岁年龄组甲型H3N2 的阳性率最高，＞59 岁以上年龄组甲型H1N1 和甲型H3N2 的阳性率较高。见表1。

表1 2017 — 2019 年北京市东城区流感样病例咽拭子核酸检测阳性样本的年龄分布Tab.1 Age distribution of influenza-like cases of which pharyngeal swab samples were positive for nucleic acid in Dongcheng District，Beijing from 2017 to 2019

2.2.2.2性别分布 2017 年4 月— 2019 年3 月，北京市东城区流感样病例咽拭子阳性样本中，男性和女性阳性率最高的为甲型H1N1，均为5.94%；阳性率最低的均为乙型BV，其中男性阳性率为0.29%，女性阳性率为0.48%。不同性别样本的甲型H1N1、甲型H3N2、乙型BV、乙型BY 阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 2017 — 2019 年北京市东城区流感样病例咽拭子核酸阳性样本的性别分布Tab.2 Gender distribution of influenza-like cases of which pharyngeal swab samples were positive for nucleic acid in Dongcheng District, Beijing from 2017 to 2019

2.3流感病毒分离培养及鉴定

2.3.1组织培养法 核酸检测阳性样本经细胞分离鉴定，获得阳性毒朱203 株，其中甲型流感毒株110份，阳性率为32.74%（110／336）；乙型流感毒株46 份，阳性率为35.66%（46 ／ 129）；甲型H1N1 流感毒株98 份，阳性率为48.28%（98 ／ 203），甲型H3N2流感毒株12 份，阳性率为9.02%（12／133）；乙型BV流感毒株1 份，阳性率为7.69%（1 ／ 13）；乙型BY流感毒株45 份，阳性率为38.79%（45 ／ 116）。流感病毒细胞分离阳性毒株集中分布于2017 年第43 周至2018 年第12 周及2018 年第51 周至2019 年第11 周，见图2，与核酸检测阳性率高峰期分布一致。

图2 流感病毒阳性毒株的时间分布Fig.2 Time distribution of influenza virus positive strains obtained

2.3.2鸡胚接种法CT＜28 的核酸检测阳性样本经鸡胚分离鉴定，获得阳性毒株20 株，其中甲型H1N1 株19 株，BY 株1 株。

3 讨 论

3.1北京市东城区流感病毒监测概况分析 2017—2019 年两个流感季均在冬春季有1 个高峰期，约分布于当年51 周至次年11 周，该结果与北京地区的报道相符［7-10］，北方地区大多有1 个流感的流行高峰，南方地区则有2 个。2017 — 2018 流感季流感病毒核酸检测阳性率高于2018 — 2019 流感季，2017 —2018 流感季甲型H1N1、甲型H3N2 和乙型BY 检出率较高，2018 — 2019 流感季以甲型H1N1 为主。流感流行的优势株在不同年度交替出现。流感病毒极易发生变异，每年在不同地区引发不同程度的流行，其中甲型流感病毒不止引发季节性流感，也多次引发全球大流行。因此，密切关注每年的优势株对流感流行趋势进行预判非常必要。

3.2北京市东城区流感病毒核酸检测结果分析 不同年龄组流感病毒核酸检测阳性率差异有统计学意义（P＜0.001），＞59 岁年龄组阳性率最高，该结果与文献［9-10］报道相符。提示60 岁以上老人是本地区流感病毒感染的高发人群，也是发生流感重症及死亡的高危人群［11］，在流感的预防和诊疗中应予以重视，以降低流感造成的疾病负担及死亡风险。0 ～4岁年龄组阳性率最低，可能是由于婴幼儿流感样病例不仅由流感病毒引起，呼吸道合胞病毒、腺病毒等也是重要病原体［12］。不同性别流感样病例病毒核酸检测阳性率差异无统计学意义（P＞0.05），表明性别对流感病毒敏感性差异较小［13］。

3.3北京市东城区流感病毒分离培养结果分析 流感病毒细胞分离培养阳性毒株时间分布与流感病毒核酸检测阳性率变化趋势基本相同，阳性毒株集中分布在核酸检测阳性率较高的时间段［14］，即流感病毒流行的高峰期病毒毒力和样本中的病毒载量要高于低发期，而病毒分离培养阳性率与这两者呈正相关。本研究采用鸡胚分离甲型H1N1 流感病毒，具有较高的阳性率，今后工作中除了重点关注甲型H1N1 的鸡胚分离株，还应探索优化其他型别流感病毒的鸡胚分离条件，提高鸡胚分离效率。

通过分析2017 —2019 两个流感季北京市东城区流感病原学检测结果，提示本地区冬春季是流感高发季节，60 岁以上的老人是流感病毒感染的高发人群，今后的防控重点应为高发季节易感人群的保护、疫苗接种及健康教育工作，提高对流感的预防意识。同时，由于流感病毒特别是甲型流感病毒的抗原变异性强，新的变异株极易引起流感大流行［15］，今后工作中应持续做好流感病毒的日常监测及分析，根据流感病毒毒株流行情况，进行相应的防控工作，为本地区流感防控策略的制定提供科学有效的依据。