Sabin 株脊髓灰质炎灭活疫苗去除2-苯氧乙醇对其质量的影响

周振歆，易力，李亚东，赵勇，段男，胡云光，付晓旭，起李光程，董少忠

中国医学科学院医学生物学研究所，云南昆明 650031

Sabin 株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine made from sabin strains，sIPV）可用于预防脊髓灰质炎，于2015 年上市，具有良好的安全性和免疫原性［1-5］，根据WHO 建议，sIPV 将成为全球消灭脊髓灰质炎的理想途径［6-7］。

目前，已获批上市的sIPV 为单剂量注射液，其三价半成品配制过程中需加入2-苯氧乙醇作为抑菌剂［8］，2-苯氧乙醇作为抑菌剂已使用数十年，其安全性较高，对疫苗质量无影响，且对人体无毒性［9-12］。抑菌剂主要用于多剂量产品，以防止疫苗瓶因反复穿刺带来的污染风险［13-14］，《中国药典》三部（2020版）［8］规定，应尽可能避免在注射剂的中间品和成品中添加抑菌剂；除另有规定外，单剂量注射液不得添加抑菌剂。因此，本研究选取3 批不含2-苯氧乙醇的单剂量sIPV 进行相关研究，以确定去除2-苯氧乙醇对sIPV 产品安全性及有效性的影响，为去除2-苯氧乙醇sIPV 生产工艺的变更奠定基础。

1 材料与方法

1.1供试品、标准品及参考品 3 批不含2-苯氧乙醇的sIPV 成品［编号：B1、B2、B3，是采用9 批单价原液（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型各3 批）按照企业注册标准（简称企标）规定的各型别D 抗原含量配制终点要求制备而成］及D 抗原标准品／ 效力参考品（定期采用中国食品药品检定研究院提供的国家标准品进行标定）均由中国医学科学院医学生物学研究所提供。

1.2数据来源 25 批上市sIPV 成品（批号：P1～P25，已获批签发合格证的含2-苯氧乙醇的sIPV 成品）的全项检测数据由中国医学科学院医学生物学研究所提供。

1.3主要试剂 牛抗Sabin-Polio lgG、兔抗Sabin-Polio IgG、2 mol ／ L H2SO4、Buffer C［磷酸盐缓冲液（pH 7.3）］及M99 稀释液均由中国医学科学院医学生物学研究所制备；BSA 购自北京索莱宝科技有限公司；0.05% Tween20 购自美国Sigma 公司；HRP标记的抗兔IgG 购自美国Thermo Fisher 公司；TMB购自美国Seracare-KPL 公司；牛血清白蛋白定量ELISA 检测试剂盒购自无锡博生医用生物技术开发有限公司；Vero 细胞蛋白质残留量检测试剂盒购自北京天坛生物制品股份有限公司；卡那霉素残留ELISA检测试剂盒购自北京勤邦生物技术有限公司。

1.4实验动物 SPF 级ICR 小鼠（20 只，雄性，28 ～35 日龄，体重为18.0 ～22.0 g）、清洁级豚鼠（8 只，雄性，42 ～56 日龄，体重为250.0 ～350.0 g）、SPF 级Wistar大鼠（510 只，雌雄各半，42 ～56 日龄，体重为175 ～200 g）均由中国医学科学院医学生物学研究所提供，动物生产许可证号为：SCXK（滇）K04-0002。本实验对动物的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行。

1.5成品检测

按照企标的要求对B1、B2、B3 批sIPV 进行全项检测和效力试验。

1.5.1D 抗原含量检测 采用ELISA 法。用Buffer C稀释Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型牛抗Sabin-Polio lgG 作为捕获抗体（稀释比例分别为1 ∶4 000、1 ∶20 000、1 ∶6 000），加入96 孔板，室温作用过夜；用封闭液（Buffer C+1%BSA）于室温封闭1.5 h；洗涤液（Buffer C + 0.05%Tween20）洗涤2 次，加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D 抗原标准品及供试品［用稀释液（Buffer C + 0.5% BSA + 0.05%Tween20）稀释为8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 DU／mL］，100 μL ／ 孔，同时设阴性对照（仅加入稀释液），4 ℃过夜；洗涤液洗涤3 次，加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型兔抗Sabin-Polio IgG（稀释比例分别为1 ∶80、1 ∶200、1 ∶100），100 μL ／ 孔，室温孵育2.5 h；加入HRP 标记的抗兔IgG（1 ∶6 500 稀释），室温作用1.5 h；洗涤液洗涤4次，加入TMB，100 mL／孔，室温显色10 min；2 mol／L H2SO4终止反应。用酶标仪检测A450／630，并进行四参数曲线拟合，获得3 个血清型的标准曲线，选取待测样品吸收值位于标准曲线线性范围内的稀释度计算D 抗原含量。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒D 抗原含量分别应在24 ～42、27 ～45、41 ～64 DU ／ 剂范围内。

1.5.2鉴别试验 同1.5.1 项方法，应证明含有脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D 抗原。

1.5.3外观 肉眼观察，应为橘红色或橘黄色液体，澄清透明无异物。

1.5.4装量、pH、游离甲醛、蛋白质含量、DNA 残留量、无菌检查、细菌内毒素、异常毒性检查、2-苯氧乙醇含量 按照《中国药典》四部（2015 版）通则的相关要求进行检测［15］，其中，异常毒性检查采用ICR小鼠及豚鼠进行试验，2-苯氧乙醇含量采用高效液相色谱法。判定标准：pH 应在6.5 ～7.5 范围内，游离甲醛应≤25 μg ／ 剂，蛋白质含量应≤10 μg ／ 剂，DNA 残留量应≤50 pg ／ 剂，细菌内毒素应＜10 EU ／ 剂。

1.5.5牛血清白蛋白残留量、Vero 细胞蛋白质残留量及抗生素残留量 分别采用定量检测牛血清白蛋白ELISA 试剂盒、Vero 细胞蛋白质残留量试剂盒及卡那霉素残留ELISA 检测试剂盒进行检测，牛血清白蛋白残留量应≤50 ng ／ 剂，Vero 细胞蛋白质残留量应≤200 ng ／ 剂，抗生素残留量应≤50 ng ／ 剂。

1.5.6效力试验 将供试品和效力参考品进行1 ∶3、1 ∶9、1 ∶27 稀释，将原倍及各稀释度的供试品和效力参考品经腿部肌肉接种Wistar 大鼠，每个稀释度10只，0.5 mL ／ 只；同时设空白对照组，注射相同体积的M99 稀释液，共10 只。接种后21 d，经心脏采血，分离血清，于56 ℃灭活30 min；采用中和试验检测血清中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒抗体，通过Reed-Muench 公式［LogED50= LogM + r × LogC，其中，M=＞50%临界中和抗体阳转率的抗体稀释度，C=稀释倍数，r=（＞50%临界中和抗体阳转率- 50%）／（＞50%临界中和抗体阳转率- ＜50%临界中和抗体阳转率）］计算ED50，中和抗体1 ∶4 为阳性纳入公式中中和抗体阳转率的计算，供试品ED50应不低于效力参考品ED50。

1.6统计学分析

1.6.1趋势分析 计算P1 ～P25 批sIPV 成品D抗原含量、pH、游离甲醛、蛋白质含量、DNA 残留量、2-苯氧乙醇含量、牛血清白蛋白残留量、Vero 细胞蛋白质残留量、抗生素残留量、细菌内毒素检测结果的平均值（x）、标准差（s）、警戒上限（x+ 2s）、警戒下限（x- 2s）、行动上限（x+ 3s）及行动下限（x- 3s），结合各检测项目的企标上、下限，与B1、B2、B3 共同绘制趋势图。绘图过程中，若警戒限或行动限超出合格限的范围，以合格限作为警戒限或行动限；残留性指标（游离甲醛、蛋白质含量、DNA残留量、牛血清白蛋白残留量、Vero 细胞蛋白质残留量、抗生素残留量）的判定标准无企标下限，因此警戒限和行动限仅绘制上限；若检测结果小于检测方法的定量下限，以定量下限值绘制趋势图。根据企标，P1 ～P25 批sIPV 成品未进行效力试验，因此，B1、B2、B3 的效力试验检测结果不进行趋势分析。

1.6.2独立样本t检验 应用SPSS 20.0 软件将不含2-苯氧乙醇的3 批sIPV（B1、B2、B3）与含2-苯氧乙醇的25 批sIPV（P1 ～P25）的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D 抗原含量分别进行独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.7稳定性评价 将B1、B2、B3 批sIPV 分别于2 ～8 ℃储存0、3、6、9、12、18、24 个月。储存0 个月时，按照企标的要求进行全项检测，储存3、6、9、18 个月时，进行外观及D 抗原含量检测；储存12 及24 个月时，进行外观、D 抗原含量检测、无菌检查及效力试验。统计D 抗原含量和效力试验检测结果，并绘制D 抗原含量趋势图。

2 结 果

2.1不含2-苯氧乙醇的sIPV 检测结果 B1、B2、B3批sIPV 的2-苯氧乙醇含量检测结果为0；其他全项检测结果均符合企标的要求；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型效力试验ED50均高于效力参考品的ED50（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型效力参考品的ED50分别为4.47、2.71、4.41）。见表1。

表1 B1、B2、B3 批sIPV 的部分质检项目检测结果Tab.1 Test results of partial items of sIPV of lots B1，B2 and B3

2.2统计学分析

2.2.1趋势分析 B1、B2、B3 批sIPV 的2-苯氧乙醇含量检测结果为0，其他检测项目的检测结果均符合企标的要求，且均在警戒限范围内波动，见图1。

图1 各批次sIPV 部分检测项目结果的趋势图Fig.1 Trends of partial test items of sIPV of various batches

2.2.2独立样本t检验 Ⅰ型病毒D 抗原含量最大值为41 DU ／ 剂，最小值为31 DU ／ 剂，均值为36 DU ／ 剂，标准差为2.936 DU ／ 剂，服从正态分布；Ⅱ型病毒D 抗原含量最大值为45 DU ／ 剂，最小值为30 DU／剂，均值为37 DU／剂，标准差为3.967 DU／剂，服从正态分布；Ⅲ型病毒D抗原含量最大值为60DU／剂，最小值为44 DU ／ 剂，均值为52 DU ／ 剂，标准差为4.411 DU／剂，服从正态分布。不含2-苯氧乙醇及含有2-苯氧乙醇sIPV Ⅰ型病毒D 抗原含量分别为36 和36DU／剂，Ⅱ型病毒D 抗原含量分别为34 和37DU／剂，Ⅲ型病毒D 抗原含量分别为53 和52 DU ／ 剂，差异均无统计学意义（t分别为-1.156、1.036、-0.375，P均＞0.05）。

2.3稳定性 B1、B2、B3 批sIPV 于2 ～8 ℃储存不同时间各项检测结果均合格，其中D 抗原含量均在企标上下限范围内波动，见图2；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型效力试验ED50均高于效力参考品的ED50，见表2；其他结果数据略。表明不含2-苯氧乙醇的sIPV 具有良好的稳定性。

表2 B1、B2、B3 批sIPV 储存不同时间效力试验的检测结果（ED50）Tab.2 Potency test on sIPV of lots B1, B2 and B3 after storage for various months（ED50）

图2 B1、B2、B3 批sIPV 储存不同时间D 抗原含量的趋势图Fig.2 Trends of D antigen contents of sIPV of lots B1，B2 and B3 after storage for various months

3 讨 论

2-苯氧乙醇作为抑菌剂广泛应用于疫苗生产中，如无细胞百白破联合疫苗、甲肝灭活疫苗等［13-14］。目前已获批上市的sIPV 中也含有2-苯氧乙醇，根据前期临床研究结果及该疫苗上市后的监测显示，含有2-苯氧乙醇的sIPV 产品质量安全、有效、可控，为预防脊髓灰质炎发挥了巨大作用［1-7，11］。随着GMP的不断推进，对于非最终灭菌无菌制剂的无菌控制取得了长足的进步。FDA 及《中国药典》已明确规定单剂量注射液不得添加抑菌剂［8，13-14］，因此，去除单剂量sIPV 中的抑菌剂2-苯氧乙醇对其质量影响的研究具有较大意义。

本研究按照企标的要求检测了3 批不含2-苯氧乙醇的sIPV（B1、B2、B3）的多项指标，并进行效力试验，与取得批签发合格证的含2-苯氧乙醇的25 批sIPV（P1 ～P25）数据进行对比分析。结果显示，B1、B2、B3 批sIPV 除2-苯氧乙醇含量检测结果为0 外（生产过程中未加入2-苯氧乙醇），其他检测指标均符合企标要求，效力试验检测结果合格，表明去除2-苯氧乙醇对sIPV 各项检测结果均无影响，产品质量合格。对B1、B2、B3 与P1 ～P25 批具有检测数值的各项指标进行趋势分析，结果显示，B1、B2、B3 批的数据均在警戒限范围内波动，表明不含2-苯氧乙醇的sIPV 产品质量稳定、可控，未受去除2-苯氧乙醇的影响。另外，独立样本t检验结果显示，B1、B2、B3 批的病毒D 抗原含量与P1 ～P25 的差异均无统计学意义（P均＞0.05），进一步表明，去除2-苯氧乙醇对产品有效性无影响。

生产工艺的变更，即使是生产工艺的微小变更，也可能造成变更后产品稳定性的改变，稳定性研究能够检测出通过结构确证研究不能检测到的细微差异［16］。因此，本研究将去除2-苯氧乙醇的B1、B2、B3批于2 ～8 ℃储存0、3、6、9、12、18、24 个月，储存0个月时，按照企标的要求进行全项检测，并增加效力试验检测；考察过程中，每个考察时间点均进行外观和D 抗原含量检测，以确定产品储存过程中的物理性状和有效性物质的变化情况；在sIPV 有效期中间点（12 个月）及有效期终点（24 个月）进行外观、D 抗原含量及无菌检查检测，并增加效力试验检测，着重考察产品有效期内的有效性和安全性指标变化情况，以确定去除2-苯氧乙醇的sIPV 稳定性情况。结果显示，产品有效期内，每个考察时间点进行的检测项目结果均合格，D 抗原含量在稳定性考察期内变化趋势稳定。表明去除2-苯氧乙醇未影响产品的有效性、安全性及有效期。

为进一步确定去除2-苯氧乙醇的工艺变更可行性，今后，还需进一步参照ICH Q5E《生物技术产品／生物制品在生产工艺变更前后的可比性》［16］及国家药品监督管理局《药品上市后变更管理办法（试行）》［17］的相关要求开展更多的研究和评估。本研究为去除2-苯氧乙醇sIPV 的生产奠定了基础。