EXT1在人类肉瘤中的表达及其临床意义

刘海涛 戚维波 杨帆 陆超 牛牛

肉瘤（sarcoma）是来源于间叶组织的恶性肿瘤，常发生于皮肤、皮下、骨膜及长骨两端，好发于成年人，主要有软组织肉瘤和骨肉瘤两种类型[1]。软组织肉瘤有50多种亚型，最常见的是多形性未分化肉瘤，其次是脂肪肉瘤（25%～30%）、平滑肌肉瘤（12%）、滑膜肉瘤（10%）等[2]。肉瘤的治疗以化疗应用最为广泛，但30%～50%的患者最终因肺转移而死亡，5年总生存率＜10%，且预后差[3]。靶向治疗是近年来出现的一种新的肿瘤治疗策略，通过阻断肿瘤血管生成来抑制肿瘤的增殖、侵袭与转移[4]。因此，探索潜在的新药物靶标联合化疗制定个体化治疗方案以改善患者预后具有重要意义。该研究通过GEO和TCGA数据库，基于生物信息学分析EXT1在肉瘤患者中的表达水平，阐明EXT1在人类肉瘤中的不同表达模式、潜在功能机制和预后价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 数据资料 GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）是一个公共功能基因组学数据库，包含高通量基因表达数据、芯片和微阵列。EXT1表达水平从GEO数据库中的GSE2719数据集（Affymetrix GPL96 platform，Affymetrix Human Genome U133A Array）下载。根据平台上的注释信息，将探针转换成相应的基因符号。GSE2719数据集包含39个人类肉瘤样本（GSM 52571-GSM52609）和15个对照样本（GSM52556-GSM52570）。

1.2 CCLE数据库分析 癌症细胞系百科全书（cancer cell line encyclopedia，CCLE）（https：//portals.broadinstitute.org/ccle）[5]整合了来自大约1,100个人类癌细胞系的基因表达，染色体拷贝数和大规模平行数据，以及24种抗癌药物在50%这些细胞系中的药理概况。CCLE数据集验证了EXT1在各癌细胞系中的表达。

1.3 实验材料 高糖培养基DMEM购自Hyclone公司，DPBS（PBS粉剂）不含钙镁购自Boster公司，10%胎牛血清（FBS）、含EDTA 0.25%胰蛋白酶均购自Gibco公司，SYBR Premix EX Taq II、Prime ScriPt RT Master Mix均购自Takara公司，DMSO（细胞培养级别）购自MP Biomedicals 公司，β-actin/EXT1引物购自安徽通用生物公司，细胞培养用青霉素-链霉素、PVDF膜（0.2uM）、QuickBlockTMWestern一抗二抗稀释液、Western转膜液、Western电泳液、QuickBlockTMWestern封闭液、Western洗涤液、Western一抗二抗去除液（弱碱性）均购自碧云天公司，EXT1一抗购自Abcam公司，二抗：HRP 标记山羊抗兔IgG购自Servicebio公司。

1.4 细胞培养 人类肉瘤细胞系（MG-63骨肉瘤、RD横纹肌肉瘤、HT1080纤维肉瘤）和相应的正常细胞（hFOB1.19人类成骨细胞细胞、HSMC人类骨骼肌细胞、WI38人类成纤维细胞）均购自赛百慷（上海）生物科学公司。所有的细胞系培养含4.5 g/L葡萄糖Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，Gibco BRL，USA）含10%胎牛血清（FBS，Gibco BRL，USA）和1%的抗生素。所有细胞均置于37 ℃、5% CO2培养箱培养。

1.5 RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR 使用Trizol试剂（Sangon Biotech，China）按照说明书从细胞中提取总RNA。2021年1月，于深圳市瑞科生物科技有限公司实验室将样本总RNA逆转录成 cDNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，China）进行逆转录反应，采用Takara Bio’s SYBR Premix Ex TaqTM II在Bio - rad CFX96 real-time PCR系统中进行实时定量PCR。PCR反应条件为95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。反应结束后，根据内参校正各个样本，计算△Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量[6]。采用以下引物：β-actin正向引物5'-AAC AGGGTGGTGGACCTCAT-3'，反向 引 物5'-GGAGGGGAGATTCAGTGTGG-3'；EXT1正向引物GCTCTTGTCTCGCCCTTTTGT；反向引物GTGGTGCAAGCCATTCCTAC。

1.6 蛋白质免疫印迹 以anti-EXT1（A-7）（Santa Cruz，USA，1∶2,000）、anti-Actin（Santa Cruz，USA，1∶4,000）作为一抗。以1∶3,000～1∶5,000比例稀释的HRP-linked anti-IgG（Santa Cruz）作为二抗。选取β-actin为内参蛋白。采用ECL化学发光自显影，利用Image J软件将目的条带灰度数值化，并与内参的灰度值作归一化处理，制作直方图。

1.7 UALCAN数据库分析 UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）使用TCGA RNA-seq和来自31种癌症类型的临床数据，对TCGA基因表达数据进行深入分析[7]。使用该数据库对EXT1表达情况与临床病理特征的相关性进行分析。

1.8 Kaplan-Meier plottor数据库分析 Kaplan-Meier plotter（http：//www.kmplot.com）分析了肉瘤患者（n=259）的总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression free survival，PFS）。患者样本根据基因的中位表达（高表达vs.低表达）分为两组，计算95%置信区间和对数等级P值的危险比（HR），并在图上显示。1.9 LinkedOmics数据库 LinkedOmics（http：//www.linkedomics.orglogin.php）包含了来自TCGA的32种癌症的多组数据[8]。使用LinkedOmics的LinkFinder模块研究TCGA肉瘤队列中与EXT1相关的差异表达基因（n=259）。EXT1共表达采用Pearson相关系数进行统计分析，并在火山图、热图或散点图中呈现。

1.10 GeneMANIA GeneMANIA（http：//www.genemania.org）是用于构建蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）的网络，阐明基因和数据集之间的关系[9]。该研究使用GeneMANIA从物理相互作用、共表达、预测、共定位和遗传相互作用等方面可视化EXT1的基因网络，并进行功能评估。

1.11 String和DAVID数据库 String数据库（https：//string-db.org/）（11.0版）是分析生物学基因或蛋白相互作用的检索工具，包含已证实以及可预测蛋白质-蛋白质相互作用的生物数据库和网络资源[10]。打开数据库输入多个差异基因，物种类型选择人类，构建靶基因的PPI网络。DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）是一个用于注释、可视化和综合发现的在线数据库，是了解多基因背后生物学意义的综合性工具[11]。使用DAVID中的基因本体论（gene ontology，GO）和《京都基因与基因组百科全书》（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）进行功能和通路富集分析。

1.12 统计学方法 使用GraphPad Prism（version 6.01）软件（GraphPad software，Inc.，La Jolla，CA，USA）进行统计分析。实验重复≥3次，计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肉瘤患者EXT1的转录水平 根据GEO数据库GSE2719数据集，EXT1 mRNA在人类肉瘤组织中表达水平为（7.696±0.153），高于癌旁组织的（5.580±0.255）（P＜0.001，95% CI：1.529～2.704），见图1A。进一步将肉瘤患者中EXT1表达水平绘制 ROC 曲线并计算曲线下面积（AUC）值，结果显示EXT1的AUC值（P＜0.001，AUC=0.9350，95% CI：0.873～0.997）对人类肉瘤具有较高的诊断价值，见图1B。

图1 EXT1基因在人类肉瘤中的表达水平及其诊断价值（GEO）

2.2 EXT1在人类不同类型肿瘤和各肿瘤细胞系中的转录水平 利用UALCAN和CCLE数据库，EXT1在人类多种肿瘤和各肿瘤细胞系中的表达水平均显著上调。在一组人类癌症中，EXT1在人类肉瘤细胞系中的表达显著升高，尤其是软骨肉瘤、骨肉瘤和尤文肉瘤。见图2和图3。

图2 EXT1在人类不同类型肿瘤中的转录水平（UALCAN）

图3 EXT1在人类各种类型肿瘤细胞系中的表达水平（CCLE）

2.3 EXT1在人类肉瘤细胞系中的表达 为验证基于微阵列数据集分析的结果，分别采用qRT-PCR和Western Blot方法检测了3个人类肉瘤细胞系（MG-63、RD、HT1080）及其对应的正常细胞（hFOB1.19、HSMC、WI38）中EXT1基因mRNA和蛋白表达情况（图4A-4B），结果证实EXT1在人类肉瘤细胞系中的表达水平明显高于正常细胞（P＜0.05），见图4C。

图4 EXT1在人类肉瘤细胞系的表达水平

2.4 EXT1表达水平与人类肉瘤患者临床病理特征的关系 使用UALCAN数据库进一步验证TCGA中260个人类肉瘤样本中EXT1表达水平与多种临床病理特征之间的相关性。结果显示，EXT1的转录水平与种族、年龄及TP53突变状态显著相关（P＜0.05），与性别无关。见图5和表1。

表1 EXT1的表达水平与肉瘤患者临床病理特征之间的相关性

表1 （续）

图5 EXT1 mRNA表达与肉瘤患者临床病理特征的关系（UALCAN）

2.5 EXT1在人类肉瘤中的预后评估价值 使用cBioPortal数据库在线数据，采用Kaplan-Meier生存曲线分析患者生存情况，高表达的EXT1在OS和PFS均有所降低，差异有统计学意义（P＜0.001，P=0.016），见图6。因此，EXT1的高表达可作为人类肉瘤患者预后不良的潜在指标。

图6 高表达的EXT1在人类肉瘤患者中的预后评估

2.6 EXT1在人类肉瘤中的共表达基因及网络分析 利用LinkedOmics的功能模块对259例TCGA 肉瘤患者的mRNA测序数据进行分析。Pearson相关检验分析EXT1与在人类肉瘤中差异表达的基因之间的相关性，有3,246个基因（暗红点）与EXT1呈显著正相关，有3,408个基因（暗绿点）与EXT1呈显著负相关（[FDR] ＜0.01），见图7A。分别选取前50个与EXT1正相关和负相关的共表达基因绘制热图，见图7B。结果表明，这些基因在人类肉瘤中具有重要研究价值，其在人类肉瘤中的生物学功能和分子机制有待进一步探索。

图7 肉瘤患者中与EXT1相关的共表达基因

2.7 EXT1及其共表达基因分析和PPI网络 进一步预测EXT1与人类肉瘤共表达基因的相互作用，利用GeneMANIA数据库构建了共表达网络，见图8A。该网络中共表达最显著的9个基因为EXT2、EXTL1、EXTL2、CPT1A、EXTL3、ANXA5、B4GALT1、B4GALT4和OSTF1。结果表明，该模块的基因主要富集于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖生物合成过程、糖胺聚糖生物合成过程和氨基聚糖生物合成过程。通过String对人类肉瘤中与EXT1相关的50个基因构建了蛋白相互作用网络，见图8B.

图8 EXT1的基因相互作用网络和蛋白相互作用网络

2.8 EXT1及其共表达基因的功能富集分析 利用DAVID数据库中的GO和KEGG对共表达基因的功能和通路富集分析。GO富集分析表明，生物过程（biological process，BP）主要是由糖胺聚糖生物合成过程、细胞分化、硫酸肝素蛋白聚糖代谢过程、细胞迁移、细胞或亚细胞成分的移动、细胞过程的调节、信号转导、细胞代谢过程引起的。分子功能（molecular function，MF）主要集中在层粘连蛋白结合、整合素结合、硫酸乙酰肝素N-乙酰氨基转移酶活性、胶原结合、蛋白结合、信号受体结合等方面。细胞成分主要集中在细胞外区域、细胞器膜和内质网膜上，见图9。KEGG通路分析表明，主要富集于细胞外基质及其受体相互作用，硫酸乙酰肝素生物合成，Rap1信号通路，Wnt信号通路，PI3K-Akt信号通路以及Ras信号通路等，见图10。

图9 EXT1及其50个共表达基因在肉瘤患者中的生物学功能富集分析

图10 EXT1及其50个共表达基因在肉瘤患者中的KEGG分析

3 讨论

目前，EXT1已经证实与多发性骨软骨瘤的发生相关，是一种常染色体显性遗传疾病，处于人类染色体8q23-24.1上的基因发生突变，所编码的蛋白质分别含有746个氨基酸，可形成异种寡聚物复合体，参与调节细胞表面硫酸乙酞肝素蛋白聚糖（HSPGs），HSPGs是生物学上最重要的糖结合物，在分子水平的各种事件中起着至关重要的作用[12]。有研究表明，HSPG参与细胞黏附、迁移、增殖和信号通路，影响肿瘤不同阶段的进展[13]。目前，相关文献报道EXT1已被确定为恶性肿瘤发生、发展及预后的分子生物标志物[14]。近年来，EXT1突变在诸多肿瘤发生发展中的表现均有所报道，如肝癌[15]、急性淋巴细胞白血病[16]、多发性骨质疏松症[17]、星形细胞瘤[18]和骨肉瘤[19]等。迄今为止，EXT1在不同类型人类肉瘤中的作用及其分子机制仍不清楚。为了更深入地了解EXT1在人类肉瘤中的表达、预后以及潜在功能，笔者对公共测序数据进行了生物信息学分析，以指导肉瘤的未来研究，主要通过GEO和TCGA的转录数据库进行研究，EXT1在人类肉瘤组织样本和细胞系中表达水平明显升高。高表达的EXT1与临床病理特征（种族、年龄和TP53突变状态）显著相关，与性别无关。与相应的正常细胞（hFOB1.19、HSMC、WI38）比较，EXT1在3种人类肉瘤细胞系（MG-63、SW872、HT1080）中基因mRNA和蛋白表达情况均呈显著过表达。此外，肉瘤患者中EXT1的高表达与不良的OS和PFS相关，提示预后不良。还利用GeneMANIA数据库构建了EXT1及其共表达基因相互作用网络，使用String数据库构建EXT1及其共同表达基因蛋白相互作用网络以获得这些基因的相互作用，利用DAVID数据库中的GO和KEGG对共表达基因的功能和通路富集分析，表明主要参与细胞分化、硫酸肝素蛋白聚糖代谢过程、细胞迁移、ECM受体相互作用，Rap1信号通路、Wnt信号通路、PI3K-Akt信号通路以及Ras信号通路等参与调控。

综上所述，EXT1在人类肉瘤中的高表达水平与肿瘤的发生发展以及对患者的预后影响有着举足轻重的作用，是非常有前途的潜在分子靶点和生物标志物，有望成为早期诊断、治疗和评估预后的生物标志物。EXT1基因在人类肉瘤中可能是一个潜在的致癌基因，有必要对该基因在肉瘤中的作用机制及生物学功能进行深入探讨，全面了解其在恶性肿瘤中的作用，为肉瘤的诊治提供更多诊断依据。该研究为EXT1在人类肉瘤发生发展中的重要性及其作为人类肉瘤标志物的潜力提供了理论依据，对人类肉瘤分子生物学特性的异质性和复杂性进行了较为全面的认识。